Ena gauna oqo†Itikotiko ena gauna oqo: OX11 0DE, Peritania, Vale ni Daimani, Harwell Saenitisi kei na Veivakavoui ni Park, Dietcote, Oxfordshire, Peritania, Daimani Rarama ni iVurevure Co.
Na vanua ni veivakacacani rarama-tatamusuki vereverea 1 (RC-LH1) sa ikoya na iwasewase ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki. Keitou vakaraitaka e rua na ituvatuva ni cryo-elekitironiki ni RC-LH1 vereverea mai na rhodopseudomonas palustris. Na 2.65-Å vakatulewa ni ituvatuva ni RC-LH114-W na veivakatorocaketaki e tiko kina na 14 subunit LH1 na isema wavolita na RC, ka sa vakataotaki mai na protein W, ni veivakatorocaketaki e sega na protein-W e taucoko na RC na ituvatuva wavolita na RC. Cerrado 16 subunidades LH1 bucle. Na veivakatautauvatataki ni veitikina oqo e solia na kila ki na dinamika ni quinone ena RC-LH1 vereverea, oka kina na veisau ni conformational sega ni vakadeitaki taumada ni sa vesuki na quinone ena vanua ni RC QB, ka vakakina na vanua ni veivuke ni quinone na vanua ni vesuki, ka vukea na Pass ira ki na RC. Na ituvatuva duatani ni W protein e tarova na sogo ni LH1 na isema, ka vakavuna kina e dua na sala me baleta na kena vakatotolotaki na veisautaki ni quinone / quinolone.
Na kaukaua e vakarautaka na photosynthesis e rawa ni vakabulabulataka voleka ni veika bula kece e vuravura, qai levu sara na kena rawa ni vakayagataki na veika bula ena matanisiga. Ni vakatorocaketaki na veivakabulabulataki ni vuravura raraba, na manumanu somidi ni veivakabulabulataki damudamu e vakaraitaka talega na veimataqali ivakarau ni kaukauwa kei na rawaka ni metabolic. Era rawa ni dro tani mai na photosynthesis ka tubu me vaka na manumanu somidi heterotrophic ena butobuto, rawa ni vakavinakataka na nitrogen kei na kaboni daiokisaiti, vakatubura na haidrojini, ka vakacacana na veika boi vinaka (1-3). Me rawa ni vakarautaki na kaukauwa me baleta na veiqaravi oqo, e dodonu me totolo ka vakavinaka na rarama me veisautaki ki na kaukauwa ni kemikali. Na iwalewale oqo e tekivu ena gauna e absorbs kina na antena ni rarama-vakacacani na rarama ka vakadewataka na kaukauwa e vakacacana ki na vanua ni veivakacacani (RC), ka tekivu kina na veibiu ni sausaumi (4 – 7). Na yavu ni iuniti ni veivakabulabulataki ena manumanu somidi ni veivakabulabulataki damudamu e vakarautaki mai na mataqali 2 RC, wavolita na rarama-tatamusuki ni veivakabulabulataki 1 (LH1), ka bulia na RC-LH1 veivakabulabulataki ni uto. LH1 e buli mai na dua na ituvatuva ni αβ heterodimers vakababa, yadua vei ira e vesuka e rua na manumanu somidi ni manumanu somidi (BChl) e dua na manumanu somidi kei na dua se rua na manumanu somidi (8-12). Na antena rawarawa duadua ni LH1 e tiko kina na 16 se 17 αβ heterodimers wavolita na RC (9-13) ena dua na iqaqalo sogo, ia ena so tale na veivakatorocaketaki ni uto, peptides ni transmembrane vakataotaka na tomani tikoga ni wavolita na LH1 , Vakakina na kena vakatorocaketaki na quinol / quinone veisoliyaki ena maliwa ni bRC1. 13-15). Na kau damudamu phototrophic Rhodopseudomonas (Rps.) e dua na ivakaraitaki ni bula ka rawa ni kila na kaukauwa kei na veisau ni elekitironiki ka tokona na photosynthesis. Na imatai ni ituvatuva ni karisitala ni Rps. Na ivakaraitaki ni palustris RC-LH1 vereverea e RC, wavolita na 15 heterodimeric LH1 na isema, ka sa vakataotaki ena dua na protein sega ni kilai ka vakatokai na "Protein W" (14). Na protein-W a qai vakatakilakilataki me vaka na RPA4402, ka sa dua na protein sega ni vakatakilakilataki 10.5kDa vata kei na tolu na helices ni veivakacacani (TMH) (16). Eda vakatura me vakayacana tale na rpa4402 na gene ni vakacurumi ni protein W ki na pufW me salavata kei na yaca e vakayagataki me baleta na gene ni vakacurumi ni RC-L, M (pufL, pufM) kei na LH1α, β (pufA, pufB) subunits. E taleitaki, na protein-W e tiko ga ena rauta ni 10% ni RC-LH1, vakaraitaka na Rps. e vakatubura e rua na veimataqali RC-LH1. Eke, eda ripotetaka na cecere-vakatulewa ni cryo-EM (cryo-EM) na ituvatuva ni rua na veivakatorocaketaki ni uto, e dua vata kei na protein W kei na 14 αβ heterodimers, na kena kadua e sega na protein W kei na dua na sogo 16 Heterodimer LH1 na isema. Na noda ituvatuva e vakaraitaka e dua na veisau ni ikalawa ena kena kilai na RC-LH1 ni Rps. palustris, baleta ni da sa vakadikeva na iwiliwili ni tamata vakatautauvata ni veimataqali yadua ka sa rauta na vakatulewa me lesi vakamatata kina na peptide yadua kei na veimataqali roka kei na lipids kei na quinones veiwekani. Na veivakatautauvatataki ni veivakatorocaketaki oqo e vakaraitaka ni tolu na TMH protein-W ka sega ni kunei ena dua tale na RC-LH1 vereverea me yacova mai oqo e vakatubura e dua na sala ni quinone me vakatotolotaka na veisau ni quinone / quinolone. E vica na vanua ni vesuki ni lipid kei na quinone maroroi sa vakatakilai mai, ka keitou sa vakaraitaka e dua na veisau vou ni veivakatautauvatataki ni oti na kena cokovata na quinone kei na RC, ka rawa ni veiganiti me baleta na itaba II (PSII) RC ni veika bula ni itaba ni oxygenated. Na noda kunea e solia na vakasama vou ki na kinetics ni quinone / quinolone vesuki kei na veisau ena RC-LH1 na uto ni veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki.
Me rawa ni vakarawarawataka e dua na vuli matailalai ni rua na veivakatorocaketaki e kune ena Rps. palustris, eda vakatikitikitaka na RC-LH1 yadua ena iwalewale ni veivakabulabulataki. Na protein W-vakacacani na veivakatorocaketaki (ena gauna oqo e vakatokai me ΔpufW) a vakasavasavataki mai na mataqali e sega kina na pufW na gene (16), ka dua ga na RC-LH1 veivakatorocaketaki e rawa ni vakayacori. Na protein W-e tiko kina na veivakatorocaketaki e buli mai na dua na mataqali. Na protein W ni mataqali oqo e veisautaki ena dua na 10x Nona ivakatakilakila ena kena C-iotioti, me rawa kina ni vakayagataki vakavinaka na protein W-e tiko kina na veivakatorocaketaki kei na levu duadua ni lailai na protein W ena kena sega ni vakayagataki na kaukamea. Na vereverea e vakavinakataki na kena wasei (16) Na veiwekani ni veiwekani (IMAC).
Me vaka e vakaraitaki ena itaba 1, ruarua na veivakatorocaketaki e tiko kina e dua na tolu na iuniti lalai ni RC (RC-L, RC-M kei na RC-H) wavolita e dua na antena ni LH1. Na 2.80-A ituvatuva ni veivakacacani e sega ni tiko kina na protein-W e vakaraitaka na 16 αβ heterodimers, ka bulia e dua na isema ni LH1 sogo taucoko wavolita na RC, ka vakatokai oqo me veivakacacani ni RC-LH116. Na 2.65Å ituvatuva ni protein-W-e tiko kina na veivakatorocaketaki e tiko kina e dua na 14-heterodimer LH1 vakataotaki mai na protein-W, ka vakatokai oqo me RC-LH114-W.
(A kei na B) Na matataki ni dela ni veivakaduavatataki. (C kei na D) Na veimataqali roka e vakaraitaki ena ititoko. (E kei na F) Na veivakacacani e laurai mai na dela ni cytoplasmic e tiko kina na peptides kei na LH1 na veitiki lalai e vakaraitaki ena katuni, ka ra sa vakanomodi ena kaloko mai na vanua ni protein-W [veiganiti kei na Rba naba. na veitiki ni yago (13)]. Me baleta na LH1-α, na roka ni iwasewase ni protein e dromodromo; me baleta na LH1-β, na roka ni iwasewase ni protein e karakarawa; me baleta na porotini-W, na porotini e damudamu; vei RC-H, e vulavula; vei RC-L, e Moli; para RC-M, damudamu. Cofactors era vakaraitaki ena ititoko, drokadroka e vakaraitaka na BChl kei na BPh e dua na veitiki, damudamu e vakaraitaka na carotenoids, kei na dromodromo e vakaraitaka na UQ10 na veitiki. (G kei na H) Vakalevutaki na rai ni protein-W na gap ena vanua tautauvata ni RC-LH114-W vereverea (G) kei na RC-LH116 vereverea (H). Cofactors vakaraitaki ena ivakarau ni vakasinaiti ni vanua, chelated quinone e vakaraitaki ena karakarawa. Na protein-W na galala e vakaraitaki ena dua na laini karakarawa ena (G), kei na qara lalai e vakatetei kina na quinone / quinolol ena mama ni LH116 e vakaraitaki ena dua na laini karakarawa ena (H).
Na itaba 1 (A kei na B) e vakaraitaka na RC wavoliti ena dolavi se sogo na veitarataravi ni LH1αβ heterodimers, yadua vei ira e vauci e rua na BChl kei na dua na carotenoid (itaba 1, C kei na D). Na vakadidike sa oti e vakaraitaka ni Rps na LH1 ni veivakacacani. Ena sala ni veivakabulabulataki ni spirulina xanthin, na veimataqali oqo e tiko kina na iwiliwili veiwaki ni veivakabulabulataki (17). Ia, na spiropyrroxanthin na carotenoid kaukauwa kei na kena density e veivakacegui. O koya gona, keitou digitaka me keitou vakaraitaka na spiroxanthin ena veivanua kece ni vesuki ni LH1. Na alfa kei na beta na TMHs duadua kei na vanua e taudaku ni membrane lekaleka (itaba 1, A, B, E, kei na F). Dina ga ni a sega ni laurai na kena levu ni 17 na vo ni C-vakaoti, na polypeptide ni alfa e a vakacacani mai na Met1 ki na Ala46 ena rua na veivakacacani. β polypeptide a vakalailaitaki mai na Gly4 ki na Tyr52 ena RC-LH116, kei na mai na Ser5 ki na Tyr52 ena RC-LH114-W. E sega ni dua na kena levu ni 3 se 4 N-vakaoti se 13 C-vakaoti ni vo ni veika e laurai (iTaba S1). Na vakadidike ni spectrometry ni levu ni RC-LH1 veiwaki vakarautaki mai na mataqali manumanu kila e vakaraitaka ni vanua e yali e vu mai na veivakacacani ni veivakacacani ni peptides oqo (iTaba S1 kei na S2). Na N-vakaoti ni α-Met1 e a laurai talega (f). Na vakadidike e vakaraitaka ni α-peptide e tiko kina na vo ni fMet1 ki na Asp42 / Ala46 / Ala47 / Ala50, kei na β-peptide e tiko kina na vo ni Ser2 ki na Ala53, ka sa duavata vinaka kei na mape ni EM ni katakata lailai.
Na veivakaduavatataki ni α-Nona29 kei na β-Nona36 e cakava na BChls mata ki na mata; heterodimer yadua αβ soqoni vata kei ira na kena weka me bulia e dua na isema dolavi (RC-LH114-W) se dua na isema sogo (RC-LH116) wavolita na RC Na exciton veiwatini na isema ni roka (irairai 1, C kei na D). Ni vakatauvatani kei na 877 nm ilawalawa ni RC-LH114-W, na 880 nm absorption damudamu ni veisau ni RC-LH116 e 3 nm (itaba 2A). Ia, na spectrum ni dichroism vakavolivolita e voleka ni tautauvata (iTaba 2B), e vakaraitaka ni dina ga ni tiko e dua na duidui matata ena maliwa ni dolavi kei na sogo ni loops, na vanua ni vanua ni BChls e tautauvata sara. Na redshift ni absorption e rawa ni vu mai na vakalailaitaki ni toso ni katakata kei na vakalevutaki ni tudei ena isema ni sogo (18, 19), na veisau ni veivakaduavatataki ni pigment e vakavuna na isema ni sogo (20, 21), se na kena cokovata na rua na kena revurevu oqo (11).
(A) Na kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa/rairai/voleka-infrared, na veiulunivanua ni kena e vakatakilakilataki ena nodra pigments veiganiti ka vakatautauvatataki ki na BPh cecere ena 775 nm. (B) Na ivakarau ni dichroism vakavolivolita e vakayagataki ki na BChl ni vakayagataki ena 805 nm. (C kei na D) Digitaki na ΔA ni veivakabulabulataki mai na gauna-vakatulewataki ni veivakabulabulataki ni RC-LH114-W vereverea (C) kei na RC-LH116 vereverea (D). Me baleta na veivakatautauvatataki vinaka cake, na veimataqali spectra kece era sa vakatautauvatataki ki na ∆A ni −A ena 0.2 ps. (E) Na ivakarau ni cytochrome c2 ni oti na vakararamataki ena kena tiko na veimataqali vakasama ni UQ2 (raica na itaba S8 me baleta na itukutuku kaukauwa). (F) Ena sela tubu ena ruku ni lailai, veimama se cecere na kaukauwa ni rarama (10, 30 se 300μMm-2 s-1, vakatautauvata), na protein W kei na RC-L na veitiki lalai ena veivakasavasavataki ni veivakaduiduitaki kei na veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki. Vakadeitaka na ivakatagedegede ni protein ena SDS-poliacrylamide gel vakalivaliva kei na immunoassay (raica na itaba S9 me baleta na itukutuku kaukauwa). Vakadeitaka na ratio me baleta na vakasavasavataki RC-LH114-W vereverea. Na ivakarau ni RC-L ki na protein-W ni veivakatorocaketaki e 1:1.
Na BChls ena itutu 1 ena vakacacani αβ14 na isema ni RC-LH114-W (itaba 1, A, C, kei na E) era voleka cake ki na RC taumada ni dausoli ka (P) ena 6.8Å mai na BChls tautauvata ena RC-LH116 (itaba. 1, B, D); ia, na kinetics ni vakayagataki ni gauna lekaleka ni rua na veivakacacani e vakaraitaka ni baleta na RC-LH114-W kei na RC-LH116, na gauna ni veisau ni kaukauwa ni veivakauqeti mai na LH1 ki na RC e 40 ± 4 kei na 44 ± 3 ps (itaba 2). , C kei na D, itaba S4 kei na teveli S2). E sega talega ni dua na duidui levu ena veisau vakalivaliva ena loma ni RC (iTaba S5 kei na ivola ni ikuri ni veiwekani). Eda vakabauta ni veitaratara voleka ni gauna ni veisau ni kaukauwa ena maliwa ni LH1 kei na RC-P e baleta na tautauvata ni yawa, angle kei na kaukauwa rawa ni levu na BChl ena rua na LH1 loops. E vaka me vakasaqaqara ena ivakarau ni kaukauwa ni LH1 me yaco ki na yawa lailai duadua e sega ni totolo cake mai na veisau vakadodonu ni kaukauwa mai na vanua suboptimal ki na RC. Na dolavi-iqaqalo LH1 iqaqalo ena RC-LH114-W e rawa ni sotava talega na toso ni katakata lailai ena ruku ni ituvaki ni katakata lailai me baleta na vakadidike ni ituvatuva, ka sa dua na mama balavu cake αβ14 ena ivakarau ni katakata ni rumu mai na yawa ni pigmentation ni βBChls ena itutu ni RC 1.
Na RC-LH116 vereverea e tiko kina e 32 na BChls kei na 16 na carotenoids, kei na kena ituvatuva raraba e tautauvata kei na kena e rawati mai na Thermochromatium (Tch. (12) kei na veikau drokadroka (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Ni oti na veitarataravi, e laurai ga na veisau lailai ena itutu ni αβ heterodimers, vakabibi na 1-5, 15, kei na 16 (iTaba S6). Na tiko ni protein-W e dua na kena revurevu levu ena ituvatuva ni LH1. Na kena tolu na TMHs era semati ena veisala lekaleka, kei na N-vakaoti ena yasa ni lumen ni veivakacacani kei na C-vakaoti ena yasa ni cytoplasmic (iTaba 1A kei na 3, A ki na D). Na protein-W e levu sara na kena hydrophobic (iVakaraitaki 3B), kei na TMH2 kei na TMH3 veimaliwai kei na LH1αβ-14 me buli kina e dua na dela ni transmembrane (iVakaraitaki 3, B kei na E ki na G). Na veitaratara e vakabibitaki kina na Phe, Leu kei na Val na kena vo ena vanua ni transmembrane. Na veitikina oqo era sa vakasoqoni vata kei na amino asidi ni wai kei na αβ-14 na roka. Eso na vo ni polar talega e cau ki na veimaliwai, oka kina na veiwekani ni haidrojini ena maliwa ni W-Thr68 kei na β-Trp42 ena dela ni kaukauwa ni kaukauwa (itaba 3, F kei na G). Ena dela ni cytoplasm, Gln34 e veivolekati kei na ilawalawa keto ni αβ-14 na veivakabulabulataki. Me kena ikuri, a vakatulewataki na n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM), kei na kena iqaqalo hydrophobic vakabalavutaki ki na veitaratara ena maliwa ni protein-W kei na αβ-14, kei na iqaqalo ni lipid e rawa ni tiko ena yago. Keitou raica talega ni sa voleka sara na vanua ni vakatulewa ni C-terminal ni protein W kei na RCH, ia e sega ni tiko ena loma ni kena buli na veimaliwai vakatabakidua (itaba 1, A kei na E). Ia, e rawa ni tiko na veimaliwai ena sega ni vakatulewataki C-vakaoti amino asidi ni rua na protein oqo, ka rawa ni vakarautaka e dua na iwalewale ni kena vakacurumi na protein-W ena gauna ni soqoni ni RC-LH114-W ni veivakatorocaketaki.
(A) Na protein-W, ka sotava na veitaratara kei na LH1αβ14 ena fomu ni katubaleka, e tiko kina e dua na isema ni yasa ni ititoko-vakatautauvatataki (damudamu), vakaraitaki ena dua na tiki ni iyaloyalo ni rawa ni livaliva (matata na vanua ni vulavula kei na dua na ivakatagedegede ni contour ni 0.13). (B) Na protein-W e vakaraitaki ena dua na roka ni wai. Na vanua ni polar kei na charged e vakaraitaki ena cyan, na vanua ni wai e vakaraitaki ena vulavula, kei na vanua kaukauwa ni wai e vakaraitaki ena moli. (C kei na D) Na protein-W e vakaraitaki ena katoni, na kena ituvatuva e tautauvata kei na (A) (C), ka veisautaki ena 180° (D). Me vaka na itutu ena veitarataravi, na residues vakaduiduitaki e taura e dua na ituvatuva ni roka ni ucacevata, na vanua e karakarawa kina na N-ivakatakilakila kei na C-ivakatakilakila e damudamu. (E) Na porotini-W ena rai vata ga me vaka ena (A), kei na kena vo ena veitaratara ni porotini-W:LH1 era vakaraitaki ena ititoko kei na ivakatakilakila e vakacurumi. (F) Na protein-W e veisautaki 90° me baleta na (E) kei na LH1αβ14 ena matataki ni katuni, ka me baleta na veitaratara ni veitaratara ena matataki ni barausa. Na veika e vo mai na beta ni polypeptide e vakatakilakilataki. Na cofactor e vakaraitaki me vaka e dua na barausa e veiganiti kei na roka ni itaba 1, na β-DDM vakacacani e vakaraitaki ena vulavula, kei na oxygen e vakaraitaki ena damudamu. (G) Na rai ena (F) e veisautaki 180°, kei na veitiki ni kilai levu ni ivakatakilakila ni alfa.
Na protein-W e sosomitaka e dua na αβ ni veivakaduiduitaki (na ika 15 ena itaba 1F), ka tarova kina na sogo ni liga kei na tilting na imatai ni tolu na αβ ni veivakaduiduitaki. E laurai ni levu duadua na kaukauwa ni kaukauwa ni imatai ni αβ-1 heterodimer me baleta na iyaloyalo ni ivakarau e 25° ki na 29° (iTaba 1, A kei na E), ka a buli mai na 2° ki na 8° kaukauwa ni αβ-1 ena RC e dua na veibasai matailalai-LH116 kei na F (itaba 1, B). Na ikarua kei na ikatolu ni heterodimers era sa vakanamata ena 12° ki na 22° kei na 5° ki na 10°, vakatautauvata. Ena vuku ni veivakataotaki ni steric ni RC, na tilt ni αβ-1 e sega ni okati kina na ikarua ni veiwatini ni αβ (ka veiganiti kei na ika 16 ni αβ ena itaba 1F), vakakina na kena buli e dua na vanua matata ena mama ni LH1 (itaba 1, A kei na E) . Ena vuku ni lailai ni rua na αβ heterodimers, vata kei na yali ni va na BChl kei na rua na veivakabulabulataki, e sega ni dua vei ira na veivakabulabulataki e vauci ki na veivakaduiduitaki αβ-1 subunit, ka vakavuna e dua na mama ni LH114-W e tiko kina e 13 na veivakabulabulataki Vegetarian kei na 28 BChls. Na vakasama ni vakatulewa ni vanua ni rua na veivanua ena αβ1 ki na 7 na vanua e lailai sobu mai vei ira na vo ni LH1 na isema, ka rawa ni vakaraitaka na palasitika vakaitaukei ni LH1 subunit volekata na vanua ni RC QB (iTaba 4) .
Na iyaloyalo ni RC-LH114-W (A kei na B) kei na RC-LH116 (C kei na D) e vakaraitaki mai na rai vata ga e cake/rai ni yasana (A kei na B) (A kei na C) kei na dela ni cavity ni Fig. Na ki rokataki e vakaraitaki ena imatau.
Na dua tale na ivakatakilakila ni uto ni vereverea kei na dua na ivakarau ni stoichiometric ni 1:14 sai koya na Rba. Ia, na protein W kei na PufX e sega ni dua na homology matata, ka sa dua na kena revurevu bibi ena nodra dui isema ni LH1. PufX e dua na TMH duadua kei na dua na vanua ni N-vakaoti ni veitaratara kei na yasa ni RC-H (13) ena dua na itutu e veiganiti kei na Rps. 116αβ-16. PufX bulia e dua na sala me baleta na veisautaki ni quinone / quinolone ena maliwa ni RC-LH1 kei na cytochrome bcl vereverea ka sa tiko ena Rba kecega. na veitiki ni yago (13). E dina ga ni veitaratara ni monomeri-duadua e tiko ena Rba. Na sphaeroides RC-LH1-PufX dimer e tiko ena itutu ni vesuki ni protein W ena RC-LH114-W, kei na lalaga e vakavuna na PufX kei na protein-W e tiko ena dua na itutu tautauvata (itaba S7A). Na lalaga ena RC-LH114-W e salavata talega kei na sala ni quinone vakasama (8) ni Pseudomonas rosea LH1, ka sa buli mai na peptides sega ni semati ki na protein W se PufX (iTaba S7B). Me kena ikuri, na sala ni quinone ena Blc. Na LH1 drokadroka ni emeralita e buli ena kena sega ni okati kina e dua na iwasewase lailai ni γ (7) e tiko ena dua na itutu tautauvata (iTaba S7C). Dina ga ni veivakaduavatataki mai na veimataqali protein, na irairai ni sala oqo ni quinone / quinolol ena dua na itutu vata ena RC-LH1 vereverea e vaka me dua na ivakaraitaki ni veisautaki ni veisau, ka vakaraitaka ni na vanua e bulia na protein W e rawa ni cakacaka me vaka e dua na sala ni quinone.
Na lalaga ena LH114-W na isema e rawa kina na kena tauyavutaki e dua na vanua ni membrane tomani tikoga ena maliwa ni vanua ni loma ni RC-LH114-W ni veivakatorocaketaki kei na membrane levu (itaba 1G), ka sega ni semati na rua na vanua ena dua na pore ni protein me vaka ena protein. Na RC-LH116 ni veivakacacani e tautauvata kei na dua na Tch sogo. Na veivakacacani vaka na nila (22) (iTaba 1H). Me vaka ni sa totolo cake na kena vakatetei na quinone ena membrane mai na kena vakatetei ena sala ni protein lailai, na dolavi ni LH114-W e rawa ni vakatara na totolo ni RC ni veisau mai na LH116 ni sogo, kei na kena vakatetei na quinone ki na RC e rawa ni vakatabui vakalevu cake. Me rawa ni vakatovolei kina se na protein W e vakaleqa na saumaki mai ni quinones ena RC, keitou a vakayacora e dua na vakatovotovo ni vakacaca ni vakacaca ena dua na vakasama ni ubiquinone 2 (UQ2) (e dua na ivakaraitaki ni UQ10 vakayago kei na dua na iqaqalo ni isoprene lekaleka) (iTaba 2E). E dina ga ni tiko na quinone chelated e vakataotaka na vakatulewa dodonu ni kena irairai ni Michaelis tudei (RC-LH114-W kei na RC-LH116 era veiganiti me baleta na 0.2 ± 0.1 μM kei na 0.5 ± 0.2 μM, vakatautauvata), na iwiliwili levu duadua ni RC-LH114-114-0. ± 5% levu cake mai na RC-LH116 (3.6 ± 0.1 e-RC-1 s-1).
Keitou a vakasamataka taumada ni protein-W e tiko ena rauta ni 10% ni veivakatorocaketaki ni uto (16); eke, na iwiliwili ni vakaitikotiko ni lailai-rarama, veimama-rarama, kei na cecere-rarama tubu ni sela e 15 ± 0.6%, 11 ± 1% kei na 0.9 ± 0.5, vakatautauvata % (iTaba 2F). Na veivakatautauvatataki ni levu ni spectrometry e vakaraitaka ni ikuri ni histidine tag e sega ni vakalailaitaka na levu ni veiwekani ni protein-W ni vakatauvatani kei na veimataqali manumanu kila (P = 0.59), o koya gona na ivakatagedegede oqo e sega ni dua na iyaya ni veisautaki ni protein-W (iTaba S10). Ia, na lailai ni vakaitikotiko oqo ni protein-W ena RC-LH1 na veivanua e rawa ni vakatara eso na RCs me ra flip ena dua na iwiliwili totolo, vakalailaitaka kina na veisau vakamalua ni quinone / quinone ena RC-LH116 na veivanua. Keitou raica ni cecere na iwiliwili ni vakaitikotiko ni rarama e sega ni salavata kei na itukutuku ni volavola ni gauna oqo, ka vakaraitaka ni pufW gene vakaraitaka na tubu ena ruku ni rarama kaukauwa (iTaba S11) (23). Na duidui ena maliwa ni pufW volavola kei na protein-W vakacurumi ki na RC-LH1 vereverea e veilecayaki ka rawa ni vakaraitaka na lawatu vereverea ni protein.
Ena RC-LH114-W, 6 na uto (CDL), 7 na yago (POPC), 1 na yago (POPG) kei na 29 na β-DDM na molecules era sa wasei ka vakatautauvatataki ena kena 6 na CDL, 24 na POPC, 2 na POPG kei na 12. RC-LH116 (iTaba 5, A kei na B). Ena rua na isema oqo, CDL e voleka ni tiko ena yasa ni cytoplasmic ni veivakatorocaketaki, ni POPC, POPG kei na β-DDM e vakalevu cake ena yasa ni luminal. E rua na lipid kei na veivakasavasavataki ni veivakasavasavataki era a vakatikitikitaki ena αβ-1 ki na αβ-6 na vanua ni RC-LH114-W ni veivakacacani (itaba 5A), kei na lima era a vakatikitikitaki ena vanua tautauvata ni RC-LH116 (itaba 5B ). E levu cake na lipids era kunei ena yasana kadua ni veivakacacani, vakabibi na CDL, vakasoqoni vata ena maliwa ni RC kei na αβ-7 ki na αβ-13 (itaba 5, A kei na B). Eso tale na lipids kei na veivakasavasavataki vakailavo era tu ena taudaku ni mama ni LH1, kei na veitiki ni acyl vakavinakataki vinaka e vakarabailevutaki ena maliwa ni LH1, vakatovotovotaki me vaka na β-DDM ena RC-LH114-W, ka vakamacalataki me vaka na β-DDM ena RC E dua na veiwaki ni βPOPC-HDLDM kei na. Na itutu tautauvata ni chelating lipids kei na veivakasavasavataki ena noda ituvatuva e vakaraitaka ni ra sa vanua ni vesuki veiganiti vakayago (iTaba S12A). Na itutu ni tautauvata ni molecules ena Tch talega e tiko na kena veiganiti vinaka. Malumu kei na Trv. Na mataqali 970 RC-LH1s (itaba S12, B ki na E) (9, 12) kei na veivakabulabulataki ni haidrojini-veiwekani ni ilawalawa ni ulu ni lipid e vakaraitaka na maroroi vinaka sara ena veitarataravi ni veitarataravi (itaba S13), ka vakaraitaka ni maroroi CDL ka vauci ki na RC (24), na vanua oqo e rawa ni comp- HRC1 maroroi.
(A kei na B) RC-LH114-W (A) kei na RC-LH116 (B) peptides e vakaraitaki ena katoni, kei na pigments e vakaraitaki ena ititoko, vakayagataki na ituvatuva ni roka ena itaba 1. Na lipids e vakaraitaki ena damudamu, kei na detergents e vakaraitaki ena vulavula. UQ vauci ki na RC QA kei na vanua ni QB e dromodromo, ni UQ tu vakatikitiki e karakarawa. (C kei na D) Na rai vata ga me vaka na (A) kei na (B), ka sega ni vakayagataki na lipids. (E ki na G) Vakalevutaki na rai ni Q1 (E), Q2 (F) kei na Q3 (G) mai na RC-LH116, kei na veitiki ni yasana ka veivakauqeti vakataki ira. Na veiwekani ni haidrojini e vakaraitaki me vaka na laini damudamu damudamu.
Ena RC-LH116, ruarua na RC QA kei na QB UQ, ka vakaitavi ena veisau ni elekitironiki ena iwalewale ni veibiu ni sausaumi, era sa vakacacani ena nodra vanua ni vesuki. Ia, ena RC-LH114-W, QB quinone e se bera ni vakavinakataki ka na veivosakitaki vakamatailalai e ra. Me ikuri ni QA kei na QB quinones, e rua na veitiki ni UQ chelated (tiko ena maliwa ni mama ni RC kei na LH1) era sa wasei ena ituvatuva ni RC-LH114-W me vaka na nodra ilawalawa ni ulu vakavinakataki (tiko ena Q1 kei na Q2, vakatautauvata). tiki ni vanua). itaba 5C). E rua na iuniti ni isoprene e lesi ki na Q1, kei na mape ni kaukauwa e walia na taucoko ni 10 na isoprene ni iqaqalo ni Q2. Ena ituvatuva ni RC-LH116, e tolu na chelated UQ10 na veitiki ni yago (Q1 ki na Q3, itaba 5D) a vakatulewataki, kei na veitiki ni yago kece e tiko kina e dua na kaukauwa matata ena loma taucoko ni iqaqalo (itaba 5, D ki na G). Ena rua na isema, na itutu ni ilawalawa ni ulu ni quinone ni Q1 kei na Q2 e vinaka sara na kena tudei (iTaba S12F), ka ra veimaliwai ga kei na RC. Q1 e tiko ena katuba ni W na gap ni RC-LH114-W (itaba 1G kei na 5, C, D kei na E), kei na Q2 e tiko volekata na vanua ni vesuki ni QB (itaba 5, C, D) kei na F). Na maroroi L-Trp143 kei na L-Trp269 na vo ni voleka sara ki na Q1 kei na Q2 ka vakarautaka na rawa ni π-vakacurumi na veimaliwai (itaba 5, E kei na F, kei na itaba S12). L-Gln88, 3.0 Å mai na okisijini vakayawa ni Q1, e vakarautaka e dua na isema kaukauwa ni haidrojini (itaba 5E); na vo oqo e maroroi ena RCs kece vakavo ga na veiwekani yawa duadua (iTaba S13). L-Ser91 e vakaisosomitaki vakavinaka me baleta na Thr ena vuqa tale na RCs (iTaba S13), e 3.8 Angstroms mai na methyl ni okisijeni ni Q1, ka rawa ni vakarautaka na veiwekani malumalumu ni haidrojini (iTaba 5E). Q3 e sega ni vaka me tiko e dua na veimaliwai vakatabakidua, ia e tiko ena vanua ni wai ena maliwa ni RC-M kei na LH1-α 5 ki na 6 (iTaba 5, D kei na G). Q1, Q2 kei na Q3 se volekata na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki sa vakavinakataki talega ena Tch. Malua, Trv. Cepa 970 y Blc. Na isema ni iris (9, 10, 12) e dusia e dua na vanua ni veivakadeitaki ni veivuke ni quinone maroroi ena RC-LH1 ni veivakacacani (iTaba S12G). Na lima na UQs vakacacani ena RC-LH116 era sa duavata vinaka kei na 5.8 ± 0.7 ni UQs yadua e vakadeitaki ena cakacaka cecere ni wai chromatography (HPLC), ni tolu na UQs vakacacani ena RC-LH114-W era sa lailai sobu mai na Na vakarautaki ni isau ni 6.2 ± 0.3 e vakaraitaka na S ituvatuva.
Na veivakatautauvatataki ni L kei na M e tiko kina e lima na TMH ka bulia e dua na veivakaduiduitaki ka cokovata e dua na dimer ni BChl, rua na BChl, rua na BChl, kei na dua na kaukamea sega ni Heme kei na dua se rua na UQ10. Ena kena tiko na isema ni haidrojini ena ilawalawa ni ketone ni icavacava kei na kena kilai na kena kumuni ena Rps, era sa vakacurumi na carotenoids ena M-subunit, ka sa vakatokai na cis-3,4-dehydroorhodopin. Veimataqali (25). Na vanua ni membrane e tautuba ni RC-H e vakadeitaki ki na membrane ena dua ga na TMH. Na ituvatuva raraba ni RC e tautauvata kei na tolu na subunit RC ni veimataqali veiwekani (me vaka na Rba). (ID ni PDB: 3I4D). Na macrocycles ni BChl kei na BPh, na carotenoid na sui kei na sega ni heme kaukamea e veicurumaki ena loma ni vakatulewa ni veivakatorocaketaki oqo, me vaka na ilawalawa ni ulu ni UQ10 ena vanua ni QA kei na QB quinone ena RC-LH116 (iTaba S15).
Na kena rawati e rua na ituvatuva ni RC kei na duidui ni QB vanua ni vakaitikotiko e solia e dua na madigi vou me dikevi kina na veisau ni conformational tudei e salavata kei na QB quinone vesuki. Ena RC-LH116 vereverea, QB quinone e tiko ena taucoko ni vauci “voleka” itutu (26), Ia na veibiu ni RC-LH114-W e sega ni tiko kina na QB quinone. E sega ni dua na QB quinone ena RC-LH114-W, ka sa veivakurabuitaki baleta ni sa cakacaka tiko na veivakatorocaketaki, vakalevu cake mai na veivakatorocaketaki ni RC-LH116 kei na veivakatorocaketaki ni QB ni veivakatorocaketaki. E dina ga ni rua na mama ni LH1 chelate me baleta na ono na quinones, lima era sa vakarautaki ena mama ni RC-LH116 sogo, ni tolu ga era sa vakaiyalayala ena mama ni RC-LH114-W dolavi . Na vakalevutaki ni leqa ni ituvatuva oqo e rawa ni vakaraitaka na totolo ni kena sosomitaki na vanua ni RC-LH114-W QB, totolo cake na kinetics ni quinone ena veivanua vereverea, kei na vakalevutaki ni kena rawa ni takosovi na LH1 na isema. Eda vakatura ni lailai na UQ ena vanua ni RC QB ni RC-LH114-W e rawa ni vu mai na dua na vereverea cake ka cakacaka vakalevu cake, kei na vanua ni QB ni RC-LH114-W sa vakamamacataki sara ga ena UQ ni veisau Na ituvatuva vakatabakidua (na icurucuru ki na vanua ni QB sa sogo e dua na conformation oqo) ref.
Ke sega na QB, na veisau vata kei na L-Phe217 ki na dua na itutu e sega ni salavata kei na UQ10 vesuki, baleta ni na vakavuna e dua na veicoqacoqa ni vanua kei na imatai ni iuniti ni isoprene ni isema (itaba 6A). Me kena ikuri, na veisau levu matata ni conformational e matata, vakabibi na helix de (helix lekaleka ena isema ena maliwa ni TMH D kei na E) na vanua e sa veisautaki kina na L-Phe217 ki na taga ni vesuki ni QB kei na veisautaki ni L-Tyr223 (iTaba 6A ) Me musuki na veiwekani ni haidrojini kei na Q5 ni vesuki ni M- vanua (iTaba 6B). Helix de pivots ena kena yavu, na Cα ni L-Ser209 e veisautaki ena 0.33Å, ni L-Val221Cα e veisautaki ena 3.52Å. E sega ni dua na veisau e laurai rawa ena TMH D kei na E, ka sa rawa ni vakacurumi ena rua na isema (iTaba 6A). Me vaka eda kila, oqo na imatai ni ituvatuva ena RC vakayago ka sogota na vanua ni QB. Na veivakatautauvatataki kei na taucoko (QB-vakadeitaki) na ituvatuva e vakaraitaka ni bera ni vakalailaitaki na quinone, e dua na veisau ni conformational e gadrevi me rawa ni curu kina na quinone. L-Phe217 veisau me bulia e dua na veimaliwai π-vakacurumi vata kei na ilawalawa ni ulu ni quinone, kei na helix veisau ki tautuba, ka vakatara na sui ni L-Gly222 kei na yasa ni sinucodo ni L-Tyr223 me bulia e dua na rede ni veiwekani ni haidrojini kei na dua na ituvatuva ni veiwekani ni haidrojini tudei (itaba 6, A kei na C).
(A) Katuni ni veicurumaki ni hologram (L sinucodo, moli/M sinucodo, magenta) kei na apo (vulavula) ituvatuva, ena kena vakaraitaki na vo ni ki ena ivakarau ni dua na matataki ni ititoko-me vaka. UQ10 e vakaraitaki ena dua na baravi dromodromo. Na laini vakadodonu e vakaraitaka na veiwekani ni haidrojini e buli ena ituvatuva taucoko. (B kei na C) Na matataki ni dela ni apolipoprotein kei na ituvatuva taucoko ni mama, vakaraitaka na yasa ni sinucodo ni oxygen ni L-Phe217 ena karakarawa kei na L-Tyr223 ena damudamu, vakatautauvata. Na iwasewase lailai ni L e moli; na veitiki lalai ni M kei na H e sega ni rokataki. (D kei na E) Apolipoprotein (D) kei na taucoko (E) RC QB vanua [roka ena (A) vakatautauvata] kei na PSII (drokadroka, karakarawa kei na palasitika quinone; ID ni PDB: 3WU2) Vakadodonutaka (58).
E sega ni namaki, e dina ga ni vica na ituvatuva ni QB-vakacacani RCs ka sega na LH1 e tiko, na veisau ni conformational e laurai ena vakadidike oqo e se bera ni ripotetaki taumada. Oqo e oka kina na ituvatuva ni vakalailaitaki ni QB mai na Blc. (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) y Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), na veika kece oqo e voleka ni tautauvata kei na nodra ituvatuva raraba ni QB. Na vakadidike voleka ni 3PRC e vakaraitaka ni LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) na veivakasavasavataki ni veivakasavasavataki e vesuki ena katuba ni itutu ni QB, ka rawa ni tarova na kena tuvanaki tale ki na dua na ituvatuva sogo. Dina ga ni sega ni vakacacani na LDAO ena dua ga na itutu ena 1EYS se 1OGV, na RCs oqo era vakarautaki ena kena vakayagataki na wainimate vata ga ka rawa kina me vakavuna na kena revurevu vata ga. Na ituvatuva ni karisitala ni Rba. E vaka talega kina me tiko e dua na vanua ni QB sogo. Ia, ena kisi oqo, na vanua ni N-vakaoti ni RC-M polypeptide (veimaliwai kei na vanua ni vesuki ni QB ena H ni vesuki ni Tyr na kena vo ena Q helix) e ciqoma e dua na ivakarau sega ni vakayago, kei na veisau ni ivakarau ni QB e sega ni vakadikevi tale (30 ). Na cava e veivakadeitaki sai koya ni da sega ni raica na mataqali deformation oqo ni M polypeptide ena ituvatuva ni RC-LH114-W, ka sa voleka ni tautauvata kei na vanua ni N-vakaoti ni RC-LH116 RC. E dodonu talega me kilai ni oti na kena vakarusai na antena ni LH1 yavutaki ena wainimate gaga, sa vakavinakataki na RCs ni apolipoprotein ena PDB, ka vakaotia na tobu ni quinone e loma kei na lipids ena maliwa ni RC kei na loma ni dela ni mama ni LH1 wavolita (31, 32). RC e cakacaka tikoga baleta ni maroroya na cofactors kece, vakavo ga na quinone ni QB e rawa ni vakacacani, ka lailai na kena tudei ka dau yali ena gauna ni vakavakarau (33). Me kena ikuri, e kilai ni kena kau laivi na LH1 kei na lipids ni cyclic vakayago mai na RC e rawa ni dua na kena revurevu ena cakacaka, me vaka na vakalekalekataki ni bula ni sausaumi-wasei P + QB-matanitu (31, 34, 35). O koya gona, keitou vakasamataka ni tiko na mama ni LH1 ni vanua e wavolita na RC e rawa ni maroroya na vanua ni “sogo” QB, ka maroroya kina na vanua ni vanua volekata na QB.
E dina ga ni apolipoprotein (sega na QB quinone) kei na ituvatuva taucoko e vakaraitaka ga e rua na iyaloyalo ni veisau ni vanua ni QB, ka sega ni dua na itukutuku ni veika e yaco, e tiko na ivakatakilakila ni rawa ni gated na vesuki me tarova na vesuki tale mai na hydroquinone Me tarova na veivakatabui ni substrate. Na veimaliwai ni quinolol kei na quinone volekata na vanua ni QB ni apolipoprotein e rawa ni duidui, ka vakavuna na kena vakasukai mai vei RC. Sa dede na kena vakaturi ni veisau ni ivakarau e vakaitavi ena kena vauci kei na kena vakalailaitaki na quinones. Na rawa ni RCs batabata me vakalailaitaka na quinones ni oti na veisau butobuto e vakaleqai (36); Na X-ray ni karisitala e vakaraitaka ni vakacaca oqo e baleta na QB quinones ni sa vesuki tu ena dua na “vakayawa” na ivakarau me baleta na 4.5 Å mai na itutu ni voleka ni cakacaka (26) , 37). Eda vakatura ni oqo na veivakadeitaki ni veivakadeitaki vakayawa e dua na iyaloyalo ni ituvaki ni maliwa ni apolipoprotein kei na ituvatuva ni mama taucoko, ka muria na veimaliwai taumada kei na quinone kei na dolavi ni vanua ni QB.
Na mataqali II RC e kune ena PSII ni veivanua eso ni manumanu somidi kei na manumanu somidi, algae kei na kau e tiko kina na kena maroroi na ituvatuva kei na cakacaka (38). Na veitarataravi ni ituvatuva e vakaraitaki ena itaba 6 (D kei na E) e vakabibitaka na tautauvata ena maliwa ni PSII RCs kei na vanua ni QB ni RC ni manumanu somidi. Na veivakatautauvatataki oqo sa dua na ivakaraitaki balavu me baleta na vulici ni veiwekani voleka ni quinone vesuki kei na vakalailaitaki. Na ivola sa oti e vakaraitaka ni veisau ni veivakatautauvatataki e salavata kei na PSII vakalailaitaki ni quinones (39, 40). O koya gona, ni vakasamataki na maroroi ni RC ni bula vakaidewadewa, na iwalewale ni vesuki oqo e sega ni laurai taumada e rawa ni vakayagataki talega ki na vanua ni QB ni PSII RC ena veivunikau ni oxygenated.
Rps ΔpufW (sega ni vakatakilakilataki pufW bokoci) kei na PufW-Nona (C-iotioti 10x Nona-vakatakilakilataki na protein-W vakaraitaki mai na vanua ni pufW vakayago) na veimataqali. CGA009 a vakamacalataki ena noda cakacaka sa oti (16). Na veimataqali oqo kei na isogenic manumanu kila-mataqali itubutubu era a vakabulai mai na friji ena kena streaking e dua na iwiliwili lailai ni sela ena PYE (yadua na 5 g lita -1) (maroroi ena LB ena -80 ° C, e tiko kina na 50% ( w / v) glycerol) protein, leveni lavetaki kei na succinate (% w) agar / v. Na peleti a vakamamacataki ena bogi ena butobuto ena ivakarau ni katakata ni rumu ena ruku ni ituvaki ni anaerobic, ka qai vakararamataki ena rarama vulavula (~ 50 μmolm-2 s-1) vakarautaka na OSRAM 116-W na cina ni halogen (RS na veitiki, UK) me baleta na 3 ki na 5 na siga me yacova ni sa basika mai e dua na koloni. E dua ga na koloni e vakayagataki me vakabulabulataki kina na 10 ml ni M22 + na veimama (41) vakaikuritaki ena 0.1% (w / v) na asidi ni casamino (ena gauna oqo e vakatokai me M22). Na itovo vakavanua e tubu ena ruku ni ituvaki lailai ni oxygen ena butobuto ena 34°C kei na luluqa ena 180 rpm me baleta na 48 na auwa, ka qai 70 ml ni itovo vakavanua e inoculated ena ruku ni ituvaki vata ga me baleta na 24 na auwa. E dua na itovo vakavanua ni semi-aerobic kei na dua na iwiliwili ni 1 ml e vakayagataki me vakasucumi kina na 30 na mililita ni M22 ena dua na tavaya iloilo matailalai ni 30 na mililita raraba ni sikivu-cake ka vakararamataki ena veivakauqeti (~ 50 μmolm-2 s-1) me baleta na 48 na auwa ena kaukauwa ni makeneta sega ni vakaluveni Veivakauqeti rod. Sa qai 30 ml ni itovo vakavanua e vakacurumi ena rauta ni 1 na lita ni itovo vakavanua ena ruku ni ituvaki vata ga, ka sa qai vakayagataki me vakacurumi kina e rauta ni 9 na lita na itovo vakavanua e vakararamataki ena ~ 200 μmolm-2 s-1 me baleta na 72 na auwa. Na sela era a tamusuki ena veivakaduiduitaki ena 7132 RCF me baleta na 30 na miniti, vakavoutaki tale ena ~ 10 ml ni 20 mM tris-HCl (pH 8.0), ka maroroi ena -20 ° C me yacova ni sa gadrevi.
Ni oti na kena vakawaicalataki, vakacuruma eso na karisitala ni deoxyribonuclease au (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) kei na rua na papa ni veivakabulabulataki ni Roche (Merck, UK) ki na veisele vakavoutaki. Ena dua na 20,000 psi na sela ni veivakasaurarataki ni Varanise (Aminco, Amerika), na sela era vakaleqai ena 8 ki na 12 na gauna. Ni oti na kena kau laivi na sela sega ni musuki kei na benu sega ni vakawaicalataki ena kena vakayagataki ena 18,500 RCF me baleta na 15 na miniti ena 4 ° C, na membrane a vakadrodroi mai na lysate ni roka ena kena vakayagataki ena 113,000 RCF me baleta na 2 na auwa ena 43,000 ° C. Biuta laivi na iwasewase ni vakawaicalataka ka vakasuka tale na roka ni roka ena 100 ki na 200 ml ni 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ka vakatautauvatataka me yacova ni sa sega na veivakasoqoni vata e laurai. Na membrane vakadaroi a vakacurumi ena 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, Amerika) e tiko kina na 2% (w / v) β-DDM me baleta na 1 na auwa ena butobuto ena 4 ° C kei na veivakauqeti malumu. Sa qai vakawaicalataki ena 70°C me vakawaicalataka na 150,000 RCF ena 4°C me baleta na 1 na auwa me kau laivi kina na vo ni sega ni vakawaicalataki.
Na ivakarau ni solubilizing mai na ΔpufW mataqali a vakayagataki ki na dua na 50 ml DEAE Sepharose ion veisautaki duru vata kei na tolu na duru ivoli (CV) ni vesuki buffer [20 mM tris-HCl (pH 8.0) e tiko kina na 0.03% (w / v) β-DDM]. Savata na duru ena rua na CV ni veivakadeitaki, ka qai savata na duru ena rua na veivakadeitaki e tiko kina na 50 mM NaCl. Na RC-LH116 vereverea a vakasavasavataki ena dua na veitarataravi ni laini ni 150 ki na 300 mM NaCl (ena vesuki ni vesuki) ena 1.75 CV, kei na vo ni vesuki vereverea a vakasavasavataki ena dua na vesuki ni vesuki e tiko kina na 300 mM NaCl ena 0.5 CV. Soqona na spectrum ni veivakabulabulataki ena maliwa ni 250 kei na 1000 nm, maroroya na iwasewase kei na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki (A880/A280) levu cake mai na 1 ena 880 ki na 280 nm, vakalailaitaka vakarua ena buffer ni vesuki, ka vakayagataka tale na iwalewale vata ga ena duru ni DEAE Ena veivakasavasavataki. Dilute na veitikina kei na A880/A280 ratios cecere cake mai na 1.7 kei na A880/A805 ratios cecere cake mai na 3.0, vakayacora na ikatolu ni rauni ni veisau ni ion, ka maroroya na veitikina kei na A880/A280 ratios cecere cake mai na 2.2 kei na A880/A805 ratios cecere cake mai na.0. Na vereverea vakasavasavataki vakatikina a vakanamata ki na ~ 2 ml ena dua na Amicon 100,000 na bibi ni molecule musuki-off (MWCO) centrifugal filter (Merck, UK), ka vakavodoki ena dua na Superdex 200 16/600 levu ni vakatikitikitaki ni duru (GE ni bula, Amerika) e tiko kina na buffer ena 200 m, 1.5 na iVoladusidusi. Soqona na spectra ni vakasucumi ni iwasewase ni vakatabui ni levu, ka vakasamataka na spectra ni vakasucumi ena A880/A280 na veivakatautauvatataki ena 2.4 kei na A880/A805 na veivakatautauvatataki ena 5.8 ki na 100 A880, ka vakayagataka sara ga me baleta na cryo-TEM grid vakavakarau se maroroi Maroroya ena -880.
Na membrane ni solubilizing mai na PufW-Nona mataqali a vakayagataki ki na dua na duru ni 20 ml ni nona vakarautaki na FF Ni-NTA Sepharose (20 ml tris-HCl (pH 8.0) e tiko kina na 200 mM NaCl kei na 0.03% (w / w)) ena IMAC ni bula (GE). v) β-DDM]. Na duru e a savati ena lima na CV ni IMAC ni veivakabulabulataki, ka qai lima na CV ni IMAC ni veivakabulabulataki e tiko kina na 10 mM histidine. Na veivakatorocaketaki ni uto e a vakasavasavataki mai na duru vata kei na lima na IMAC ni veivakabulabulataki e tiko kina na 100 mM histidine. Na iwasewase e tiko kina na RC-LH114-W vereverea e vakanamata ki na ~ 10 ml ena dua na tani vakauqeti vakaiyaragitaki ena dua na Amicon 100,000 MWCO vakasavasavataki (Merck, UK), vakawaicalataka 20 na gauna ena buffer ni vesuki, ka qai vakacurumi ki na 25 ml Ena buffer ni DEAE b ena gauna taumada. Savata na duru ena va na CV vesuki buffers, qai elute na vereverea ena walu na CVs ena dua na linear gradient ni 0 ki na 100 mM NaCl (ena vesuki buffer), kei na vo ni va na CVs e tiko kina na 100 mM vesuki buffer Na vo ni vereverea chlobin ena so8de2. cecere cake mai na 2.4 kei na A880/A805 ratio cecere cake mai na 4.6 na iwasewase era a vakanamata ki na ~ 2 ml ena dua na Amicon 100,000 MWCO vakasavasavataki, ka vakasinaiti ena 1.5 CV IMAC ena liu Buffer vakatautauvatataki Superdex 200 vakasavasavataki ena 16/60 1.5 na iVoladusidusi. Soqona na spectra ni vakayagataki ni veitiki ni levu-vakatikitikitaki ka vakasamataka na spectra ni vakayagataki kei na A880/A280 na veivakatautauvatataki ena 2.1 kei na A880/A805 na veivakatautauvatataki ena 4.6 ki na 100 A880, ka sa vakayagataki sara ga me baleta na vakavakarau ni grid ni TEM batabata se maroroi ena -80°C.
E dua na Leica EM GP ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki e vakayagataki me vakarautaka na grids ni TEM ni katakata lailai. Na vereverea a vakawaicalataka ena IMAC buffer ki na A880 ni 50, ka qai 5μl a vakavodoki ki na dua na kaukauwa vou-vakasukai QUANTIFOIL 1.2 / 1.3 kaboni-vakacurumi kopa mesh (Agar vakasaenisi, UK). Vakabulabulataka na grid ena 20 ° C kei na 60% na ivakarau ni katakata me baleta na 30 s, qai vakamamacataka me baleta na 3 s, ka qai bokoca ena ethane wai ena -176 ° C.
Na itukutuku ni RC-LH114-W vereverea a volai ena eBIC (Vanua ni Bioimaging vakalivaliva) (ivurevure ni rarama ni daimani ni Peritania) vata kei na dua na misini lailai ni Titan Krios, ka cakacaka ena dua na vakatotolotaki ni volivolitaki ni 300kV, vata kei na dua na vakalevutaki ni yaca ni 130,000 ni-V kei na dua na E dua na Gatan 968 GIF levu vata kei na K2 cecere ni vakadidike a vakayagataki me volai na iyaloyalo ena ivakarau ni wiliwili me kumuni kina na itukutuku. Na levu ni pixel vakarautaki e 1.048Å, kei na ivakarau ni kaukauwa e 3.83 e-Å-2s-1. Soqona na iyaloyalo ena 11 na sekodi ka wasea ki na 40 na iwasewase. Vakayagataka na vanua e vakasinaiti ena kaboni me vakanamata tale kina na misini ni rai, qai kumuna e tolu na iyaloyalo ena dua na qara. Ena kena levu taucoko, 3130 na iyaloyalo era a vakasoqoni vata, kei na defocus na isau ena maliwa ni -1 kei na -3μm.
Na itukutuku me baleta na RC-LH116 vereverea a vakasoqoni vata ena kena vakayagataki na misini ni vakadidike vata ga ena vale ni vakadidike ni veika bula ni Asterbury (Univesiti ni Leeds, UK). Na itukutuku a kumuni ena ivakarau ni wiliwili ena dua na vakalevutaki ni 130 k, kei na levu ni pixel a vakarautaki ki na 1.065 Å ena dua na kaukauwa ni 4.6 e-Å-2s-1. E katoni na iyaloyalo oqo ena 12 na sekodi qai wasei ina 48 na iwasewase. Ena kena levu taucoko, 3359 na iyaloyalo era a vakasoqoni vata, kei na defocus na isau ena maliwa ni -1 kei na -3μm.
Na itukutuku kece ni veiqaravi e vakayacori ena paipo ni Relion 3.0 (42). Vakayagataka na Motioncorr 2 (43) me vakadodonutaki kina na toso ni bimi ena kena vakabibitaki na kaukauwa, ka qai vakayagataka na CTFFIND 4.1 (44) me vakadeitaka na CTF (cakacaka ni veisau ni veibasai) paramita. Na ivakaraitaki ni itaba ni oti na itekitekivu ni veiqaravi oqo e vakaraitaki ena itaba 2. S16. Na ivakaraitaki ni digidigi vakataki koya e vakatuburi ena kena digitaki vakataki koya e rauta ni 250 na pixels ni 1000 na tikitiki ena dua na 250-pixels na ituvatuva ka sega ni dua na ivakamacala rua-vakatautauvata (2D) na veiwasei, vakakina na kena cakitaki na veiwasei oqori e sotava na ivakaraitaki ni vakadukadukalitaki se sega na kena ivakatakilakila e laurai rawa. Oti, a vakayacori na digidigi vakataki koya ena veitiki ni iyaloyalo kece sara, kei na RC-LH114-W e 849,359 na tikitiki, kei na RC-LH116 vereverea e 476,547 na tikitiki. Na veitiki kece digitaki sa lako curuma e rua na rauni ni sega ni vakatutu 2D vakailawalawa, ka ni oti na cici yadua, na veitiki ka sotava na vanua ni kaboni, ivakaraitaki ni vakadukadukalitaki, sega ni dua na ivakatakilakila matata se kaukauwa na veitiki ni veitiki era sa vakasukai, ka vakavuna na 772,033 (90.9%) kei na 359,657% vakayagataki ni veitiki are3578 ()d . RC-LH114-W kei na RC-LH116 vakatautauvata. Na ivakaraitaki ni veidusimaki taumada ni 3D a vakayacori ena kena vakayagataki na iwalewale ni lutu ni stochastic. Vakayagataka na ivakaraitaki taumada me vaka e dua na ivakadinadina, na veitiki digitaki era sa vakawasei ki na va na iwasewase ena 3D. Vakayagataka na ivakaraitaki ena iwasewase oqo me vaka e dua na ivakadinadina, vakayacora na 3D vakasavasavataki ena veitikina ena iwasewase levu duadua, qai vakayagataka na imatai ni 15Å lailai-pasi ni vakasaqa me ubia na vanua ni vakasavasavataki, kuria na 6 na pixels ni malumu ni iyalayala, kei na post-cakacaka na pixels me vakadodonutaka na Gatan K2 transfer function cecere ni Mo. Me baleta na itukutuku ni RC-LH114-W, na ivakaraitaki taumada oqo a veisautaki ena kena kau laivi na kaukauwa ni kaukauwa ena yasa ni matavulo (sega ni semati mai na kaukauwa ni kaukauwa ni uto ena UCSF Chimera). Na ivakaraitaki e rawati (na vakatulewa ni RC-LH114-W kei na RC-LH116 e 3.91 kei na 4.16 Å, vakatautauvata) e vakayagataki me vaka e dua na ivakadinadina me baleta na ikarua ni rauni ni 3D ni veiwasei. Na veitiki e vakayagataki era vakailawalawataki ki na kalasi taumada ni 3D ka sega ni tiko kina na veiwekani kaukauwa kei na itikotiko. Overlap se lailai na veivakasama matata ni ituvatuva. Ni oti na ikarua ni rauni ni 3D vakawasoma, na iwasewase kei na vakatulewa cecere duadua a digitaki [Me baleta na RC-LH114-W, e dua na iwasewase e 377,703 na tikitiki (44.5%), me baleta na RC-LH116, e rua ga na iwasewase, taucoko ni W era sa4me. ni oti na veisau taumada kei na dua na duidui lailai]. Na veitiki digitaki era sa vakasukai tale ena dua na kato 400-pixel ka vakavinakataki ena 3D vakavinakataki. Na iubi ni veivakabulabulataki e vakatuburi ena kena vakayagataki na imatai ni 15Å lailai-pasi ni filita, 3 pixel mape ni vakarabailevutaki kei na 3 pixel malumu ni iubi. Vakayagataka na veitiki ni CTF vakavinakataki, veitiki ni toso ni veivakadodonutaki kei na ikarua ni rauni ni veitiki ni CTF vakavinakataki, 3D vakavinakataki, masking ni solvent kei na post-vakarautaki e vakayacori ni oti na veisala yadua me vakavinakataki tale kina na texture e rawati. Vakayagataka na FSC (Fourier shell veiwekani coefficient) musuki-off na isau ni 0.143, na vakatulewa ni iotioti ni ivakaraitaki ni RC-LH114-W kei na RC-LH116 e 2.65 kei na 2.80Å, vakatautauvata. Na FSC ni iotioti ni ivakaraitaki e vakaraitaki ena itaba 2. S17.
Na veitarataravi ni protein kece era lavetaki mai na UniProtKB: LH1-β (PufB; ID ni UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; iD ni duabau: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID ni duabau: O83005); RC-M (PufM; ID ni UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID ni UniProt: A0A4Z9); Protein-W (PufW; ID ni duabau: Q6N1K3). SWISS-ivakaraitaki (45) a vakayagataki me tara kina e dua na ivakaraitaki ni homology ni RC, ka tiko kina na veitarataravi ni protein ni RC-L, RC-M kei na RC-H kei na ituvatuva ni karisitala ni Rba. RC ni sphaeroides a vakayagataki me vaka e dua na ivakaraitaki (PDB ID: 5LSE) (46). Vakayagataka na “mape veiganiti” iyaya ni cakacaka ena UCSF Chimera me veiganiti kei na ivakaraitaki vakatuburi ki na mape (47), vakavinakataka na isema ni protein, kei na cofactor [4 × BChl e dua na (monomer valenivolavola ni yaca = BCL), 2 × BPh e dua na (BPH), e dua se rua na mataqali UQ10 (U10), dua na sega ni o koya kei na 3,4-dihidroheksakarbonilkolina (QAK)] vakayagataka na Coot (48) me vakaikuritaka. Me vaka ni sega ni tiko na QAK ena valenivolavola ni monomer, a vakarautaki ena kena vakayagataki na iyaya ni cakacaka ni eLBOW ena PHENIX (49).
Tarava, sa qai tara na iwasewase lailai ni LH1. Taumada, na iyaya ni tara vakataki koya ena PHENIX (49) a vakayagataki me tara vakataki koya e dua na tiki ni LH1 na veitarataravi ni vakayagataki na mape kei na LH1-α kei na LH1-β na veitarataravi ni protein me vaka na vakacuru ilavo. Digitaka na subunit taucoko duadua ni LH1, kauta laivi ka vakavodoki ki na Coot, vakacuruma ena liga na veitarataravi ni yali ena kena, ka vakasavasavataka ena liga na ituvatuva taucoko ni bera ni vakuria e rua na BCls e dua na (BCL) kei na dua na spirilloxanthin (CRT) [me vaka na Rps veiganiti Na density ni LH1 vereverea kei na kilai. Veimataqali (17)]. Kopitaka na iwasewase taucoko ni LH1, ka vakayagataka na UCSF Chimera “Iyaya ni cakacaka ni mape ni vakavodoki” me vakavodoki ena vanua sega ni ivakaraitaki voleka ni LH1 na kena levu, ka qai vakavinakataka ena Coot; tokaruataka na iwalewale me yacova ni sa vakatotomuri kece na LH1 lalai. Me baleta na ituvatuva ni RC-LH114-W, ena kena kau laivi na kena levu sega ni vakarautaki ena Coot, na protein e wasei mai na vo ni veitiki sega ni protein ena mape ni USCF Chimera kei na iyaya ni cakacaka ni Autobuild e vakayagataki me tauyavutaki kina na ivakaraitaki taumada, kei na vo ni subunits (protini-W) ivakaraitaki. Na FINISI (49). Kuria na veitarataravi cava ga e yali ki na ivakaraitaki e rawati ena Coot (48), ka qai vakavinakataka vakataki koya na subunit taucoko. Na vo ni sega ni vakarautaki na kena levu e veiganiti kei na kena cokovata na lipids (PDB monomer ID ni CDL = CDL, POPC = 6PL kei na POPG = PGT), β-DDM ni veivakasavasavataki (LMT) kei na UQ10 na veivakasavasavataki (U10). Vakayagataka na PHENIX vakavinakataki (49) kei na vakavinakataki ni ivola ena Coot (48) me vakavinakataki kina na ivakaraitaki taumada taucoko me yacova ni sa sega ni rawa ni vakavinakataki tale na iwiliwili ni ivakaraitaki kei na ivakarau ni rai ni kena veiganiti. Kena itinitini, vakayagataka na LocScale (50) me vakasavasavataka na mape ni vanua, ka qai vakayacora e vica tale na veisau ni vakatautauvatataki na density sega ni vakarautaki kei na vakavinakataki vakataki koya kei na ivola.
Na veimataqali peptides, cofactors kei na so tale na lipids kei na quinones vakavodoki ena loma ni nodra dui kaukauwa e vakaraitaki ena itaba 1 kei na 2. S18 ki na S23. Na itukutuku ni iwiliwili ni iotioti ni ivakaraitaki e vakaraitaki ena Teveli S1.
Vakavo ga ke vakaraitaki vakatani, na UV / Vis / NIR na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki era a kumuni ena dua na veivakabulabulataki ni Cary60 (Agilent, Amerika) ena 1 nm na veimama mai na 250 nm ki na 1000 nm kei na dua na gauna ni veivakaduavatataki ni 0.1s.
Vakalailaitaka na ivakaraitaki ena dua na cuvette ni kuata kei na dua na sala ni 2 mm ki na A880 ni 1, ka kumuna na spectrum ni absorption ena maliwa ni 400 kei na 1000 nm. Na veimama ni dichroic vakavolivolita era a kumuni ena dua na Jasco 810 na veimama ni veimama (Jasco, Japani) ena 1 nm na maliwa ni 400 nm kei na 950 nm ena dua na ivakarau ni vakadidike ni 20 nm min-1.
Na molar vakarusai na ivakarau e vakadeitaki ena kena vakalailaitaki na veivakatorocaketaki ni uto ki na dua na A880 ni rauta ni 50. Vakalailaitaka na 10μl na iwiliwili ena 990μl na buffer ni vesuki se methanol, ka kumuna na spectrum ni vakasucu ena gauna sara ga oqo me vakalailaitaka na vakacacani ni BChl. Na BChl ni veivakatovotovo yadua ni methanol e vakarautaki ena kena vakarusai na 771 nm ni 54.8 mM-1 cm-1, ka vakadeitaki na kena vakarusai (51). Wasea na vakarautaki ni BChl vakasama ena 32 (RC-LH114-W) se 36 (RC-LH116) me vakadeitaka na vakasama ni vereverea ni uto, ka sa qai vakayagataki me vakadeitaka na ivakarau ni absorption ni ivakaraitaki vata ga e kumuni ena buffer ni vakarusai ni coefficient. tautauvata. E tolu na veivakatovolei vakawasoma e tauri me baleta na ivakaraitaki yadua, kei na ivakatautauvata ni absorbance ni BChl Qy cecere duadua e vakayagataki me baleta na vakasama. Na vakarusai ni RC-LH114-W vakarautaki ena 878 nm e 3280 ± 140 mM-1 cm-1, ia na vakarusai ni RC-LH116 vakarautaki ena 880 nm e 3800 ± 30 mM-1 cm-1.
UQ10 a vakarautaki me vaka na iwalewale ena (52). Me vakalekalekataki, a vakayacori na veisautaki ni iwasewase ni HPLC (RP-HPLC) ena kena vakayagataki na ivakarau ni HPLC ni Agilent 1200. Vakawaicalataka me baleta na 0.02 nmol ni RC-LH116 se RC-LH114-W ena 50μl ni 50:50 methanol: chloroform e tiko kina na 0.02% (w/v) chloride ni ferric, ka vakacuruma na pre-equilibrated Beckman Coulter Ultrasphere m1 40 ° C ena HPLC vakalivaliva (80: 20 metanol: 2-propanol) ena dua na duru × 25 cm. Vakayacora na veivakasavasavataki ni isocratic ena dua na iwali ni HPLC me raica na absorbance ena 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) kei na 780 nm (BChl) me baleta na 1 na auwa. Na cecere ena 275 nm na roka ni roka ena 25.5 na miniti e a vakacurumi, ka sega ni tiko kina e dua tale na veivakaduavatataki e rawa ni laurai. Na vanua ni vakaduavatataki e vakayagataki me vakarautaki kina na levu ni molar ni UQ10 e lavetaki vata kei na kena vakayagataki na curve ni calibration vakarautaki mai na kena vakacurumi na ivakatagedegede savasava mai na 0 ki na 5.8 nmol (iTaba S14). Na ivakaraitaki yadua e vakadikevi ena tolu na vakatovotovo, kei na cala e ripotetaki e veiganiti kei na SD ni ivakatautauvata.
E dua na iwali e tiko kina na RC-LH1 vereverea kei na dua na Qy cecere duadua ni 0.1 a vakarautaki vata kei na 30 μM vakalailaitaki na ose ni loma ni cytochrome c2 (Merck, Igiladi) kei na 0 ki na 50 μMUQ2 (Merck, Igiladi). Tolu na ivakaraitaki ni 1-ml era vakarautaki ena veivakasama yadua ni UQ2 ka incubated ena bogi ena butobuto ena 4°C me vakadeitaka na veisau taucoko ki na butobuto ni bera na veivakatovolei. Na iwali e a vakavodoki ki na dua na OLIS RSM1000 ivakarau ni vakaraitaki ni 300 nm bukawaqa / 500 laini ni grating, 1.24 mm ni curu, 0.12 mm ni lomadonu kei na 0.6 mm ni curucuru. E dua na 600 nm balavu ni pasi ni vakasaqa e biu ena katuba ni ivakaraitaki ni itaba kei na ivakadinadina ni itaba ni itaba me kakua ni okati kina na rarama ni veivakauqeti. Na vakasucumi e a vakaraitaki ena 550 nm kei na dua na gauna ni vakaduavatataki ni 0.15 s. Na excitation rarama e vakau mai na 880 nm M880F2 LED (rarama Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) ena dua na wa ni optic ni fiber ena 90% kaukauwa ena dua na DC2200 lewa (Thorlabs Ltd., UK) ka sa vakau yani ki na ivurevure ni rarama ni °0 ena dua na. Na bimi ni veivakarautaki e veibasai kei na iloilo me vakasuka e dua na rarama ka sega ni a vakayagataki taumada ena ivakaraitaki. Mo raica na vakasucu 10 s ni bera na rarama ni 50 s. Sa qai vakaraitaki tale na absorbance me baleta na 60 s ena butobuto me vakalewai na levu ni kena vakalailaitaka vakataki koya na quinolol na cytochrome c23 + (raica na itaba S8 me baleta na itukutuku kaukauwa).
Na itukutuku e vakayacori ena kena vakacurumi e dua na iwiliwili taumada ni linear ena loma ni 0.5 ki na 10 s (vakatau ena UQ2 vakasama) ka vakatautauvatataki na iwiliwili ni tolu kece na ivakaraitaki ena veivakasama yadua ni UQ2. Na RC-LH1 vakasama e vakarautaki mai na veivakaduiduitaki ni veivakarusai e vakayagataki me veisautaki kina na iwiliwili ki na cakacaka ni catalytic, droinitaki ena itekitekivu ni Pro 2019 (itekitekivu ni Lab, Amerika), ka vakatautauvatataki ki na ivakaraitaki ni Michaelis-Menten me vakadeitaka na kena irairai ni Km kei na Kcat.
Me baleta na veivakatovolei ni absorption vakalekaleka, na ivakaraitaki ni RC-LH1 a vakalailaitaki ki na ~ 2μM ena IMAC buffer e tiko kina na 50 mM na sodium ascorbate (Merck, Amerika) kei na 0.4 mM na Terbutin (Merck, Amerika). Na asidi ni ascorbic e vakayagataki me vaka e dua na isolisoli ni elekitironiki ni solibula, kei na tert-butaclofen e vakayagataki me vaka e dua na QB ni veivakabulabulataki me vakadeitaka ni sa vakalailaitaki tikoga na dausoli RC levu (o ya, sega ni photooxidized) ena gauna taucoko ni veivakatovolei. E rauta ni 3 ml ni ivakaraitaki e vakacurumi ki na dua na ivakarau ni veisautaki ni sela (me baleta na 0.1 m ena kena raba, 350 RPM) vata kei na dua na 2 mm na balavu ni sala ni mata me vakadeitaka ni ivakaraitaki ena sala ni laser e rauta na gauna me baleta na veisau butobuto ena maliwa ni pulses ni veivakauqeti. Vakayagataka ~ 100-fs pulses ni laser me vakalevutaka na Ti: Safaia ivakarau ni laser (Spectra Fisiki, Amerika) me vakauqeta na ivakaraitaki ena 880 nm ena dua na ivakarau ni tokaruataki ni 1 kHz (20 nJ me baleta na NIR se 100 nJ me baleta na Vis). Ni bera ni kumuni na itukutuku, vakaraitaka na ivakaraitaki ki na rarama ni veivakauqeti me baleta na 30 na miniti. Na vakaraitaki ena vakavuna na sega ni cakacaka ni QA (e rawa ni vakalailaitaka na QA vakadua se vakarua). Ia yalovinaka mo kila ni iwalewale oqo e rawa ni veisautaki baleta ni oti e dua na gauna balavu ni veisau butobuto, RC ena lesu tale vakamalua ki na itaviqaravi ni QA. E dua na ivakarau ni Helios (ivakarau ni totolo sara, Amerika) a vakayagataki me vakarautaka na ivakarau ni gauna lekaleka kei na dua na gauna ni vakadede ni -10 ki na 7000 ps . Vakayagataka na parokaramu ni komipiuta ni Xplorer ni dela ni (ivakarau ni Ultrafast, Amerika) me ungroup na itukutuku ni itukutuku, qai cokovata ka vakatautauvatataki. Vakayagataka na pakete ni parokaramu ni komipiuta ni CarpetView (Rarama ni saumaki mai Ltd., Lithuania) me vakayagataki kina na itukutuku cokovata me rawati kina na spectra duidui e semati ki na kena vakacacani, se vakayagataka e dua na cakacaka e convolves e vuqa na exponents kei na isau ni iyaya ni cakacaka me veiganiti kei na dua-wavelength ni spectral ni veisau ena itekitekivu, USALa).
Me vaka e sa tukuni oti mai cake (53), e dua na iyaloyalo ni veivakabulabulataki e tiko kina na LH1 vereverea e sega kina na RC kei na antena ni LH2 vakavolivolita e vakarautaki. Na membrane a vakawaicalataki ena 20 mM tris (pH 8.0) ka qai vakavodoki ki na dua na cuvette ni kuata kei na dua na sala ni mata 2 mm. E dua na 30nJ laser ni kaukauwa e vakayagataki me vakauqeta na ivakaraitaki ena 540 nm kei na dua na gauna ni vakaberaberataki ni -10 ki na 7000 ps. Vakayacora na itukutuku ni seti me vaka e vakamacalataki me baleta na Rps. ivakaraitaki ni pal.
Na membrane a vakacacani ena kena vakasavasavataki ena 150,000 RCF me baleta na 2 na auwa ena 4°C, ka qai vakavotukanataki tale na kena vakayagataki ena 880 nm ena 20 mM tris-HCl (pH 8.0) kei na 200 mM NaCl. Vakawabokotaka na membrane ena kena vakamalumalumutaki vakamalua ena 2% (w/v) β-DDM me baleta na 1 na auwa ena butobuto ena 4°C. Na ivakaraitaki a vakawaicalataki ena 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) ki na dua na vakasama ni protein ni 2.5 mg ml-1 (vakadidike ni Bio-Rad). E vakayacori tale eso na cakacaka mai na iwalewale sa tabaki oti (54), tekivu ena kena vakalailaitaki na 50 μg na protein ki na dua na iwiliwili ni 50 μl TEAB e tiko kina na 1% (w / v) na sodium laurate (Merck, Igiladi). Ni oti na sonication me baleta na 60 s, a vakalailaitaki vata kei na 5 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine (Merck, UK) ena 37 ° C me baleta na 30 na miniti. Me baleta na S-alkylation, vakatubura na ivakaraitaki kei na 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) ka vakuria mai na dua na iwali ni ivoli ni isopropanol 200 mM me baleta na 10 na miniti ena ivakarau ni katakata ni rumu. Na vakasavasavataki ni proteolytic a vakayacori ena kena vakacurumi na 2 μg trypsin / endoproteinase Lys-C veiwaki (Promega UK) ka vakatuburi ena 37 ° C me baleta na 3 na auwa. Na surfactant ni laurate a lavetaki ena kena vakacurumi na 50 μl ni ethyl kei na 10 μl ni 10% (v / v) LC kalasi ni trifluoroacetic asidi (TFA; Vakasaenisi ni dauqoli katakata, UK) kei na vortexing me baleta na 60 s. Na veibiu ni iwasewase e vakatorocaketaki ena kena vakayagataki na 15,700 RCF me baleta na 5 na miniti. Me vaka na ivakarau ni dauteitei, e dua na duru C18 spin (Thermo dauqoli vakasaenisi, UK) a vakayagataki me qarauni vakavinaka ka vakasavasavataka na iwasewase e ra e tiko kina na peptide. Ni oti na vakamamacataki ena vakasavasavataki ni vacuum, na ivakaraitaki a vakawabokotaki ena 0.5% TFA kei na 3% acetonitrile, kei na 500 ng a vakadikevi ena nanoflow RP chromatography vata kei na spectrometry levu ena kena vakayagataki na ivakarau ni ivakarau e vakamacalataki taumada.
Vakayagataka na MaxQuant v. itukutuku ni veivakabulabulataki ni manumanu somidi (www. Na itukutuku ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki sa vakacurumi ena veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki ena veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki ena ruku ni ivakatakilakila ni itukutuku PXD020402.
Me baleta na vakadidike mai na RPLC vata kei na kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa, na RC-LH1 vereverea a vakarautaki mai na Rps ni mataqali manumanu kila. Vakayagataka na iwalewale sa tabaki oti (16), na vakasama ni protein e caka ena sela ni palustris e 2 mg ml-1 ena 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl kei na 0.03% (w/v) β- (vakadidike ni Bio-Rad) ) DDM. Me vaka na ivakarau ni dauteitei, vakayagataka na iyaya ni veivakasavasavataki 2D (GE ni veiqaravi ni bula, Amerika) me kau tani kina na 10 μg na protein ena iwalewale ni veivakabulabulataki, ka vakawabokotaka na veivakabulabulataki ena 20 μl 60% (v / v) asidi ni formic (FA), 20% (v / v) Acetonitrile / 20% water. Lima na microliters era a vakadikevi mai na RPLC (Dionex RSLC) vata kei na spectrometry levu (Maxis UHR-TOF, Bruker). Vakayagataka na MabPac 1.2 × 100 mm duru (Thermo dauqoli vakasaenisi, UK) me baleta na veibiu ena 60 ° C kei na 100 μlmin -1, vata kei na dua na gradient ni 85% (v / v) vakawaicalataki A [0.1% (v / v) FA kei na 0.02% (v / v) ena 90% (v / v) acetonitrile TFA] Vakayagataka na ivakatagedegede ni ivurevure ni ionization ni electrospray kei na ivakarau ni ivakarau me baleta na sivia na 60 na miniti, na spectrometer levu e rawata na 100 ki na 2750 m / z (levu-ki-sausaumi ratio). Ena veivuke ni ExPASy bioinformatics ivurevure ni katuba ni iyaya ni cakacaka FindPept (vakasaqara na iyaya ni cakacaka), mapetaka na spectrum ni levu ki na subunits ni veivakacacani.
Na sela era a tubu me baleta na 72 na auwa ena ruku ni 100 ml NF-lailai (10 μMm-2 s-1), veimama (30 μMm-2 s-1) se cecere (300 μMm-2 s-1) rarama. M22 na veimama (M22 na veimama ena kena sa biu laivi na amoniumi kei na sodium ni sucu sa sosomitaki ena sodium ni sucu) ena dua na 100 ml na tavaya ni sikivu-cake (23). Ena lima na 30-s na veisau, 0.1 na micron na bilo bilo era a biu ena dua na iwiliwili ni 1:1 me lyse na sela ka vakamamacataki ena aisi me baleta na 5 na miniti. Na ka e sega ni rawa ni vakawaicalataki, na sela sega ni musuki kei na bilo bilo era a kau laivi ena kena vakayagataki na 16,000 RCF me baleta na 10 na miniti ena dua na idabedabe lailai ni idabedabe. Na membrane a wasei ena dua na Ti 70.1 rotor vata kei na 100,000 RCF ena 20 mM tris-HCl (pH 8.0) vata kei na dua na 40/15% (w/w) sucrose gradient me baleta na 10 na auwa.
Me vaka e vakamacalataki ena noda cakacaka sa oti, na kena laurai na Nona ivakatakilakila ena PufW (16). Me vakalekalekataki, na vakasavasavataki ni uto ni vereverea (11.8 nM) se na membrane e tiko kina na vakasama vata ga ni RC (vakadeitaki ena oxidation kauta laivi na vakalailaitaki ni duidui ni spectrum ka veiganiti kei na icolacola ena gel vakacacani) ena 2x SDS vakavodoki buffer (Merck, UK) vakalailaitaki vakarua. Na protein era a wasei ena dua na ivakaraitaki 12% bis-tris NuPage gel (vakasaenisi ni dauqoli katakata, UK). E dua na gel a vakasinaiti ena Coomassie karakarawa kaukauwa (Bio-Rad, UK) me vakavodoki ka raitayaloyalotaka na iwasewase lailai ni RC-L. Na protein ena ikarua ni gel a vakadewataki ki na methanol-vakacakacakataki na polyvinylidene fluoride (PVDF) na ibulibuli (vakasaenisi ni dauqoli katakata, UK) me baleta na immunoassay. Na membrane ni PVDF a vakatabui ena 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) ena maliwa ni-20 kei na 5% (w / v) pauta ni sucu skimmed, ka qai vakatuburi vata kei na anti-Nona antibody taumada (ena buffer na mHl 7.6), 150 mM NaCl kei na 0.05% (v/v) Tween-20] ena 1:1000 A190-114A, Valenivolavola ni Bethyl, Amerika) me baleta na 4 na auwa. Ni oti na savasava 3 na gauna me baleta na 5 na miniti ena buffer ni veivakabulabulataki, na membrane a cokovata kei na peroxidase ni ose (Sigma-Aldrich, UK) veivakabulabulataki ni ikarua ni kalavo (vakalailaitaki 1: 10,000 ena veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki) (Cyanagen, Itali) kei na iyaloyalo ni Amersham 600 (Veiqaravi ni Bula ni GE, Igiladi).
Ena kena droinitaki na veiwaseyaki ni kaukauwa ni veitiki yadua ni veivakacacani se na sala ni immunoassay, vakaduavatataki na vanua ena ruku ni cecere ka vakarautaka na kaukauwa ni RC-L (vakacacani) kei na Protein-W (immunoassay), ena ImageJ (57) Vakarautaka na iyaloyalo. Na veivakatautauvatataki oqo era a veisautaki ki na veivakatautauvatataki ni molar ena kena nanumi ni veivakatautauvatataki ni RC-L ki na protein-W ena ivakaraitaki savasava ni RC-LH114-W e 1: 1 ka vakatautauvatataka na itukutuku taucoko e vakarautaki me vakakina.
Me baleta na ikuri ni iyaya me baleta na itukutuku oqo, yalovinaka raica na http.
Oqo e dua na itukutuku ni rawa-ka e dolavi ka veisoliyaki ena ruku ni veidinadinati ni Laiseni ni Veivakadeitaki ni Veika Vakaitaukei. Na itukutuku e vakatara na vakayagataki sega ni vakatabui, veisoliyaki, kei na kena vakadewataki ena dua na sala ena ruku ni ituvaki ni cakacaka taumada e cavuti vakadodonu.
iVakamacala: Keitou kerei iko ga mo vakarautaka na nomu itikotiko ni imeli me rawa kina vua na tamata o vakatura ki na tabana e kila ni o vinakata me ra raica na imeli ka sega ni spam. Eda na sega ni taura e dua na itikotiko ni imeli.
Na taro oqo e vakayagataki me vakatovolei kina se o iko e dua na dausiko vanua ka tarova na vakau ni spam vakataki koya.
David J. K.
Na ituvatuva cecere-vakatulewa ni rarama ni veivakarerei 1 vereverea ena vanua ni veivakacacani e vakarautaka na vakasama vou ki na dinamika ni quinone.
David J. K.
Na ituvatuva cecere-vakatulewa ni rarama ni veivakarerei 1 vereverea ena vanua ni veivakacacani e vakarautaka na vakasama vou ki na dinamika ni quinone.
©2021 iSoqosoqo ni Amerika me baleta na Toso ni Saenisi. dodonu kece e maroroi. AAAS es un partner de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef y COUNTER. Na toso ki liu ni saenisi 2375-2548.