Ena gauna oqo *Itikotiko ena gauna oqo: Koloni 50931, Jamani, Koloni Vakadidike ni ilawalawa vinaka duadua ena isau ni lomaocaoca ni sela ena mate e baleta na qase (CECAD).
Na vakacacani ni uto ni mate ni uto e vakasamataki me sega ni rawa ni veisautaki baleta ni vakaiyalayala na palasitika ni uto, ia na kena revurevu ni vakacacani ni uto ena galala ni sela ni uto ena yago e sega ni matata vinaka. Eke, eda vakaraitaka na proteome ni sela-vakatabakidua ni Purkinje na veitiki ni yago kei na toso ki liu ni OXPHOS lailai e vakavuna na vakaleqai ni veitiki ni yago ni veitiki ni yago. Keitou kunea ni vakacacani ni mitochondrial e vakavuna e dua na veisau titobu ena vanua ni proteomics, ka tini sara ena kena vakayacori na veitarataravi ni parokaramu ni metabolic dodonu ni bera na mate ni sela. E sega ni namaki, keitou vakadeitaka na kena vakacurumi matata na pyruvate carboxylase (PCx) kei na so tale na enzymes ni veivakacacani ka vakaikuritaka na veimama ni TCA ni veisau. Na kena tarovi na PCx e vakalevutaka na lomaocaoca ni oxidative kei na vakacacani ni uto, e vakaraitaka ni mate ni uto e dua na kena itataqomaki ena uto e sega kina na OXPHOS. Na vakalesui mai ni fusion ni mitochondrial ena veitiki ni yago sa vakacacani vakaoti e veisautaka vakadua na itovo ni yago oqo, ka tarova kina na mate ni sela. Na veika eda kunea e vakaraitaka na sala sega ni kilai taumada ka solia na kaukauwa ki na vakacacani ni mitochondrial ka vakaraitaka ni rawa ni veisautaki na vakacacani ni uto ena gauna mada ga ni oti na mate.
Na itavi bibi ni mitochondria ena maroroi ni kaukauwa ni uto e vakabibitaki ena ivakatakilakila raraba ni uto e salavata kei na mate ni uto ni tamata. E vuqa vei ira na mate oqo e vakavuna na veisau ni gene ka vakatulewataka na vakaraitaki ni gene (1, 2) se na vakarusai ni gene e semati ki na dinamika ni gene, ka vakaleqa vakadodonu na tudei ni DNA ni gene (mtDNA) (3, 4). Na cakacaka ena ivakaraitaki ni manumanu e vakaraitaka ni kena saumi na vakacacani ni mitochondrial ena veitiki ni yago wavolita, e rawa ni vakayacori na sala ni metabolic maroroi (5-7), ka vakarautaka na itukutuku bibi me baleta na kila titobu ni pathogenesis ni mate vereverea oqo. Ena kena veibasai sara, na noda kila na veisau ni metabolic ni mataqali sela vakatabakidua e vakavuna na vakacacani raraba ni uto ni uto (ATP) e yavutaki (8), vakabibitaka na gadrevi me kilai na takete ni veiqaravi e rawa ni vakayagataki me tarova se tarova na mate. Tarova na mate ni uto (9). Na lailai ni itukutuku sa ikoya na dina ni sa vakasamataki raraba na sela ni nerve me vakaiyalayala sara na veisau ni metabolic ni vakatauvatani kei na mataqali sela ni veitiki wavolita (10). Ni sa soli vei ira na sela oqo e dua na itavi bibi ena kena vakarautaki na veiqaravi ni metabolites ki na neurons me vakatorocaketaka na taranisimisani ni synaptic ka sauma na ituvaki ni mavoa kei na mate, na kena rawa ni veisautaki na veisautaki ni sela ki na ituvaki dredre ni uto ni uto e voleka ni vakaiyalayala ga ki na sela ni glial (11-14). Me kena ikuri, na veivakaduiduitaki ni sela ni uto e vakataotaka vakalevu na vuli ni veisau ni metabolic e yaco ena veiwasewase lalai ni neuronal vakatabakidua. Na kena itinitini, lailai na ka e kilai me baleta na kena revurevu dodonu ni sela kei na metabolic ni vakacacani ni mitochondrial ena neurons.
Me rawa ni kilai na veivakacacani ni metabolic ni veivakacacani ni veivakacacani, keitou a vakatikitikitaka na veivakacacani ni veivakacacani ni veivakacacani (PNs) ena veimataqali ituvaki ni veivakacacani ni veivakacacani e vakavuna na kena vakarusai na veivakacacani ni veivakacacani e taudaku ni veivakacacani (Mfn2). E dina ga ni Mfn2 veisau ena tamata e semati vata kei na dua na mataqali mate ni vakasama ni moto ni sucu kilai me vaka na Charcot-Marie-Tooth mataqali 2A (15), na vakarusai ni ituvaki ni Mfn2 ena kalavo e dua na kilai vinaka ni kena vakacurumi na vakacacani ni vakasama (OXthoPHOS). Na veimataqali lailai ni uto (16-19) kei na kena isau ni uto e salavata kei na ivakatakilakila ni uto toso ki liu, me vaka na leqa ni toso (18, 19) se na ataxia ni uto (16). Ena kena vakayagataki e dua na isoqoni ni ivakatakilakila-galala ni iwiliwili (LFQ) proteomics, metabolomics, iyaloyalo, kei na iwalewale ni virological, eda vakaraitaka ni toso ki liu ni neurodegeneration kaukauwa e vakavuna na pyruvate carboxylase (PCx) kei na veika tale eso e vakaitavi ena arteriosclerosis ni PNs ena vivo Na ivakaraitaki ni enzymes. Me vakadeitaka na kena veiganiti na kunei oqo, keitou vakatabakidua sobu-vakalawataki na vakaraitaki ni PCx ena Mfn2-sega ni PNs, ka kunea ni cakacaka oqo e vakalevutaka na lomaocaoca ni oxidative kei na vakatotolotaki ni neurodegeneration, ka vakadinadinataka kina ni azoospermia e solia na mate ni sela Metabolic veisautaki. Na vakaraitaki bibi ni MFN2 e rawa ni vakabulai vakaoti na PN ni vakacacani ni itinitini kei na lailai ni OXPHOS bibi, vakayagataki vakalevu ni DNA ni mitochondrial, kei na kena irairai ni sa musuki na rede ni mitochondrial, ka vakabibitaka tale ni ivakarau oqo ni vakacacani ni yago e rawa sara mada ga ni vakabulai ena ituvaki ni vakacacani ni sela ni bera mada ga.
Me rawa ni raitayaloyalotaki na veitiki ni yago ena Mfn2 tukituki PNs, keitou vakayagataka e dua na mataqali kalavo ka vakatara na veitiki ni yago vakararavi ena Cre me taketetaka na dromodromo ni protein (YFP) (mtYFP) (20) Cre ivakamacala ka dikeva na veitiki ni yago ena vivo. Keitou kunea ni kena vakarusai na Mfn2 na gene ena PNs ena vakavuna na veiwasei vakamalua ni rede ni mitochondrial (iTaba S1A), kei na veisau taumada e kunei ena 3 na macawa ni yabaki. Ena kena veibasai, na vakacacani levu ni PN na sela ni tabana, me vaka e vakadinadinataki ena kena yali na Calbindin na immunostaining, e sega ni tekivu me yacova na 12 na macawa ni yabaki (iTaba 1, A kei na B). Na gauna e sega ni veiganiti ena maliwa ni veisau taumada ena ivakarau ni yago kei na itekitekivu e laurai ni mate ni yago e vakauqeti keda me da vakadikeva na veisau ni metabolic e vakavuna na vakacacani ni yago ni bera na mate ni sela. Keitou vakatorocaketaka e dua na fluorescence-vakacakacakataki na sela ni veiwasei (FACS)-yavutaki na iwalewale me vakatikitikitaki kina na YFP (YFP +)-vakaraitaki PN (iTaba 1C), kei na kalavo ni lewa (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- cegu-loxP: : L7-cre), e muri oqo e vakatokai me CT1BRL (iTaba). Na kena vakavinakataki na iwalewale ni gating e yavutaki ena kaukauwa ni veiwekani ni sikinala ni YFP e rawa kina vei keda me da vakasavasavataka na yago ni YFP + (YFPhigh) ni PNs mai na sega ni PNs (YFPneg) (itaba S1B) se na tikitiki ni axon / dendritic ni putative (YFPlow; itaba S1D, veivakadeitaki mai na imawi). Me rawa ni vakadeitaki kina na ivakatakilakila ni iwiliwili ni tamata vakalawataki, keitou vakayacora na LFQ proteomics ka qai vakadidike ni iwasewase levu, ka kunei ni tiko e dua na veibiu matata ena maliwa ni YFPhigh kei na YFPneg na sela (iTaba S1C). YFPhigh na sela e vakaraitaka e dua na rede ni vakavutuniyautaki ni kilai PNs ivakatakilakila (oya na Calb1, Pcp2, Grid2 kei na Itpr3) (21, 22), ia e sega ni dua na vakavutuniyautaki ni protein e dau vakaraitaki ena neurons se so tale na mataqali sela (iTaba 1D) ). Na veivakatautauvatataki ena maliwa ni ivakaraitaki ena veimataqali YFPhigh na sela era kumuni ena veivakatovolei tudei e vakaraitaka e dua na veiwekani ni veiwekani> 0.9, vakaraitaka na veivakavoui vinaka ena maliwa ni veivakatautauvatataki ni bula (iTaba S1E). Me vakalekalekataki, na itukutuku oqo e vakadeitaka na noda ituvatuva me baleta na veivakaduiduitaki bibi kei na vakatabakidua ni PN rawarawa. Baleta na ivakarau ni draiva ni L7-cre e vakayagataki e vakavuna na veivakaduavatataki ni mosaic ena imatai ni macawa ni oti na vakasucu (23), keitou sa tekivu me keitou vakamatea na kalavo mai na CTRL kei na ituvaki (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-tu-loxP :: L7-cre) Soqona na neurons. Ni sa vakacavari na kena vakavoutaki, e vakatokai me Mfn2cKO ena 4 na macawa ni yabaki. Me vaka na itinitini, keitou digitaka na 8 macawa ni yabaki ni sa bulabula vinaka tu na PN ni ilawalawa dina ga ni sa matata na veiwasei ni mitochondrial (itaba 1B kei na itaba S1A). Ena kena levu taucoko, keitou vakarautaka e dua na iwiliwili ni 3013 na protein, ka rauta ni 22% era yavutaki ena MitoCarta 2.0 ivakamacala e yavutaki ena protein ni kaukauwa me vaka na kaukauwa ni kaukauwa (iTaba 1E) (iTaba 1E) (24). Na vakadidike ni duidui ni gene vakaraitaka e vakayacori ena macawa 8 e vakaraitaka ni 10.5% ga ni veimataqali kece e tiko kina na veisau bibi (iTaba 1F kei na itaba S1F), ka 195 na veimataqali era sa sobu-vakalawataki ka 120 na veimataqali era sa cake-vakalawataki (iTaba 1F). E dodonu me da kila ni “vakadidike ni sala vou” ni itukutuku oqo e vakaraitaka ni duidui vakaraitaki na genes vakabibi e baleta e dua na vakatabui ni sala ni metabolic vakatabakidua (iTaba 1G). E taleitaki, e dina ga ni kena vakalailaitaki na sala e semati ki na OXPHOS kei na sikinala ni kalikali e vakadeitaka na kena vakacurumi na vakacacani ni mitochondrial ena PNs ni fusion-sega ni rawa, eso tale na iwasewase e vakaitavi vakalevu kina na veisautaki ni amino acid e vakalevutaki vakalevu, ka sa salavata kei na veisautaki ni mitochdrion e yaco ena P. sega ni cakacaka.
(A) Na itaba ni confocal ni mata ni iwasewase ni uto ni CTRL kei na Mfn2cKO na kalavo e vakaraitaka na toso ni yali ni PNs (calbindin, vulavula); niukilia era a vakacacani ena DAPI. (B) Vakatautauvatataki ni (A) (dua na sala ni vakadidike ni veisau, *** P <0.001; n = 4 ki na 6 na maliwa lala mai na tolu na kalavo). (C) Na cakacaka ni veivakatovolei. (D) Veisoliyaki ni mape ni katakata ni ivakatakilakila vakatabakidua ki na Purkinje (e cake) kei na mataqali sela tale eso (lomadonu). (E) Venn iyaloyalo e vakaraitaka na iwiliwili ni veitiki ni yago e laurai ena PN vakailawalawa. (F) Na vanua ni volukano ni veivakaduiduitaki ni vakaraitaki ni veivakaduiduitaki ena Mfn2cKO ni veivakabulabulataki ena 8 na macawa (bibi ni veivakaduiduitaki ni 1.3). (G) Na vakadidike ni sala ni veibuli e vakaraitaka na lima na sala bibi duadua ni cake-lawa (damudamu) kei na sobu-lawa (karakarawa) sala ena Mfn2cKO PN vakawasoma me vaka na 8 macawa. Na ivakatautauvata ni ivakatagedegede ni vakaraitaki ni protein yadua e kunei e vakaraitaki. Mapa ni katakata ni vulavula: veisautaki na isau ni P. ns, sega ni bibi.
Na itukutuku ni proteomics e vakaraitaka ni sa lailai sobu vakamalua na kena vakaraitaki na protein ni veitiki ni yago I, III, kei na IV. Na veivakatorocaketaki I, III, kei na IV kece e tiko kina na veitiki bibi ni mtDNA-vakacurumi, ia na veivakatorocaketaki II, ka sa niukilia-vakacurumi ga, e sega ni vakaleqai vakalevu (iTaba 2A kei na itaba S2A). . Me salavata kei na veika e rawati mai na proteomics, na immunohistochemistry ni veitiki ni yago ni uto e vakaraitaka ni MTCO1 (iwasewase ni uto ni uto 1) na ivakatagedegede ni uto ni IV ena PN e lutu sobu vakamalua (iTaba 2B). Na mtDNA-vakacurumi Mtatp8 a vakalailaitaki sara vakalevu (itaba S2A), ni sa sega ni veisau na ivakatagedegede ni tudei ni niukilia-vakacurumi ATP synthase, ka sa salavata kei na kilai tudei ATP synthase subunit F1 vereverea ni sa tudei na mtDNA vakaraitaka. Na kena buli e tudei. Vakataotaka (7). Na vakatovotovotaki ni ivakatagedegede ni mtDNA ena PNs ni Mfn2cKO vakarautaki ena gauna dina ni veivakacacani ni veivakacacani (qPCR) e vakadeitaka na kena vakalailaitaki vakamalua na naba ni ilavelave ni mtDNA. Ni vakatauvatani kei na ilawalawa ni lewa, ena 8 macawa ni yabaki, e rauta ni 20% ga ni ivakatagedegede ni mtDNA A maroroi (iTaba 2C). Me salavata kei na veika oqo, na vakayagataki ni veivakacacani ni Mfn2cKO PNs me kunei kina na DNA, ka vakaraitaka na gauna-vakararavi ni vakayagataki ni veivakacacani ni veivakacacani (itaba 2D). Keitou kunea ni so ga na veidigitaki era vakaitavi ena vakacacani ni protein ni mitochondrial kei na isau ni lomaocaoca era a vakalawataki cake, oka kina na Lonp1, Afg3l2 kei na Clpx, kei na OXPHOS na veika vereverea ni soqoni. E sega ni dua na veisau levu ena ivakatagedegede ni protein e vakaitavi ena apoptosis e laurai (iTaba S2B). Vakakina, keitou kunea ni veitiki ni yago kei na sala ni reticulum ni endoplasmic e vakaitavi ena veivakau ni kalikali e lailai ga na veisau (iTaba S2C). Me kena ikuri, na vakatovotovotaki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki e sega ni kune e dua na veisau bibi, ka sa salavata kei na kena vakaraitaki na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki e laurai ena vivo ena veivakabulabulataki kei na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki (iTaba S3). Ia, na toso ki liu ni OXPHOS ena PNs e salavata kei na veisau matata ni veivakatorocaketaki ni veivakatorocaketaki. Na ilawalawa ni mitochondrial e rawa ni laurai ena yago ni sela kei na vunikau ni dendritic ni Mfn2cKO PNs yabaki 5 kei na 8 na macawa, kei na ituvatuva ni membrane e loma sa sotava na veisau titobu (iTaba S4, A kei na B). Me salavata kei na veisau oqo ni ultrastructural kei na dua na lutu levu ena mtDNA, vakadidike ni veitiki ni uto ni uto kei na tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) e vakaraitaka ni sa lutu sobu sara na kena rawa ni vakayagataki na membrane ena Mfn2cKO PNs (iTaba S4C).
(A) Na gauna ni vuli ni vakadidike ni ivakatagedegede ni vakaraitaki ni OXPHOS vereverea. Vakasamataka ga na protein kei na P <0.05 ena 8 na macawa (ANOVA ni rua na sala). Laini vakadodonu: Sega ni dua na veisau ni vakatauvatani kei na CTRL. (B) Mawi: E dua na ivakaraitaki ni dua na iwasewase ni uto vakatakilakilataki ena veivakacacani ni MTCO1 (ivakarau ni ivakarau, 20 μm). Na vanua e taukena na yago ni sela ni Purkinje e ubia tu na dromodromo. Matau: Vakatautauvatataki ni ivakatagedegede ni MTCO1 (dua na sala ni vakadidike ni veisau; n = 7 ki na 20 na sela vakadidike mai na tolu na kalavo). (C) qPCR vakadidike ni mtDNA naba ni ilavelave ena PN vakarautaki (dua na sala ni vakadidike ni veisau; n = 3 ki na 7 na kalavo). (D) Mawi: E dua na ivakaraitaki ni dua na tiki ni cerebellar vakatakilakilataki ena dua na veivakacacani ni DNA (ivakarau ni ivakarau, 20 μm). Na vanua e taukena na yago ni sela ni Purkinje e ubia tu na dromodromo. Matau: Vakatautauvatataki ni mtDNA na mavoa (dua na sala ni vakadidike ni veisau; n = 5 ki na 9 na sela mai na tolu na kalavo). (E) E dua na ivakaraitaki ni dua na iwasewase ni uto kaukauwa e vakaraitaka na mitoYFP + Purkinje na sela (kaci) ena dua na katokatoni ni clamp ni sela taucoko. (F) Vakatautauvatataki ni IV ni curve. (G) Na itukutuku ni mata ni veivakacacani ni gauna oqo ena CTRL kei na Mfn2cKO Purkinje na sela. Na ivakatakilakila e cake: Na imatai ni pulse e vakavuna na AP. Na ivakatakilakila e ra: Na levu duadua ni AP vakawasoma. (H) Na vakalevutaki ni veivakacurumi vakataki koya ni veivakabulabulataki (sPSPs). Na mata ni katokatoni ni ivakatakilakila kei na kena ratio ni zoom e vakaraitaki ena (I). E dua na sala ni vakadidike ni veisau vakadikevi n = 5 ki na 20 na sela mai na tolu na kalavo. Na itukutuku e vakaraitaki me vaka na ibalebale ± SEM; *P<0,05; ** P<0,01; ***P<0,001. (J) Na ivakatakilakila ni mata ni AP vakataki koya e volai ena kena vakayagataki na ivakarau ni clamp ni patch perforated. Na ivakatakilakila e cake: Na levu duadua ni AP vakawasoma. Na ivakatakilakila e ra: vakalevutaka e dua na AP. (K) Vakarautaka na ivakatautauvata kei na levu duadua ni AP vakawasoma me vaka na (J). Na veivakatovolei nei Mann-Witini; n = 5 na sela era a vakadikevi mai na va na kalavo. Na itukutuku e vakaraitaki me vaka na ibalebale ± SEM; sega ni bibi.
Na vakacaca ni OXPHOS matata e laurai ena Mfn2cKO PN ni 8 na macawa, ka vakaraitaka ni cakacaka ni yago ni neurons e sa rui vakaloloma. O koya gona, keitou vakadikeva na ivakarau ni livaliva ni OXPHOS-vakacacani na neurons ena 4 ki na 5 na macawa kei na 7 ki na 8 na macawa ena kena vakayacori na itukutuku ni clamp ni sela taucoko ena veitiki ni cerebellar kaukauwa (itaba 2E). E sega ni namaki, na ivakatautauvata ni vakacegu ni membrane rawa kei na veivakacacani ni veivakacacani ni Mfn2cKO neurons e tautauvata kei na kena lewa, e dina ga ni tiko na duidui matailalai ena maliwa ni sela (Teveli 1). Vakakina, ena 4 ki na 5 na macawa ni yabaki, e sega ni dua na veisau levu ena veimaliwai ni gauna oqo-volitaki (IV curve) e kunei (iTaba 2F). Ia, e sega ni dua na Mfn2cKO neurons 7 ki na 8 na macawa na bula mai na ivakarau ni IV (ikalawa ni veivakacacani), e vakaraitaka ni tiko e dua na vakasama matata ki na rawa ni veivakacacani ena gauna ni bera oqo. Ena kena veibasai, ena Mfn2cKO na veitiki ni yago, na depolarizing ni veivakacacani ka vakavuna na veivakacacani ni cakacaka vakawasoma (AP) e vosota vinaka, ka vakaraitaka ni nodra ivakarau ni veivakacacani raraba e sega ni duatani sara mai vei ira na 8-macawa-makawa ni veitiki ni yago (Teveli 1 kei na itaba 2G). Vakakina, na vakawasoma kei na amplitude ni veivakacacani ni postsynaptic vakataki koya (sPSCs) e vakatautauvatataki ki na ilawalawa ni lewa, kei na vakawasoma ni veika e yaco e tubu mai na 4 na macawa ki na 5 na macawa ki na 7 na macawa ki na 8 na macawa ena dua na tubu tautauvata (iTaba 2, H kei na I). Na gauna ni matua ni veivakabulabulataki ena PNs (25). Na veika vata ga oqo e rawati ni oti na veivakacacani ni PNs. Na ituvatuva oqo e tarova na kena rawa ni saumi na cala ni ATP ni sela, me vaka e rawa ni yaco ena taucoko-sela ni patch ni clamp ni volavola. Vakabibi, na vakacegu ni membrane rawa kei na vakacaca ni veivakacacani ni Mfn2cKO ni veivakacacani e sega ni vakaleqai (itaba 2, J kei na K). Me vakalekalekataki, na veika oqo e vakaraitaka ni PNs kei na matata ni OXPHOS dysfunction e rawa ni vosota na ivakarau ni vakasukasuka cecere-vakawasoma vinaka, ka vakaraitaka ni tiko e dua na iwalewale ni veivakadodonutaki e rawa kina vei ira me ra maroroya na isau ni electrophysiological voleka-ivakarau.
Na itukutuku e vakaraitaki me vaka na kena ibalebale ± SEM (dua na sala ni vakadidike ni veisau, Holm-Sidak ni veivakatovolei ni veivakatautauvatataki e vuqa; * P <0.05). Na naba ni iuniti e vakaraitaki ena veivakadeitaki.
Keitou sa vakarautaka me keitou vakadikeva kevaka e dua na iwasewase ena itukutuku ni proteomics (iTaba 1G) e oka kina na sala e rawa ni vorata kina na leqa bibi ni OXPHOS, ka vakamacalataka kina na vuna e rawa ni maroroya kina na PN e vakaleqai na voleka ni-ivakarau ni livaliva (iTaba 2, E ki na K). . Na vakadidike ni proteomics e vakaraitaka ni veivakabulabulataki e vakaitavi ena catabolism ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki (BCAA) e vakalevutaki cake (iTaba 3A kei na itaba S5A), kei na iotioti ni ka e rawa ni vakaikuritaka na tricarboxylates ena acteriosclerosis. Keitou kunea ni sa tubu ruarua na veika e tiko ena BCAA 1 (BCAT1) kei na BCAT2. Era catalyze na imatai ni kalawa ni BCAA catabolism ena kena vakatuburi na glutamate mai na α-ketoglutarate (26). Na veitiki kece era bulia na veitiki ni keto asidi ni veivakatorocaketaki (BCKD) vereverea era sa vakavotukanataki (na vereverea e vakavuna na kena muri ka sega ni veisautaki rawa na kena vakacacani na BCAA ni kaboni e rawati) (itaba 3A kei na itaba S5A). Ia, e sega ni dua na veisau matata ena BCAA vakataki koya e kunei ena PN vakarautaki, ka rawa ni baleta na kena vakalevutaki na kena vakayagataki na sela ni amino acid bibi oqo se na kena vakayagataki na ivurevure tale eso (suka se lactic acid) me vakaikuritaka na veisau ni TCA (iTaba S5B). PNs sega ni OXPHOS vakaraitaka talega na vakalevutaki ni glutamine vakacacani kei na cakacaka ni transamination ena 8 na macawa ni yabaki, ka rawa ni vakaraitaki ena kena vakalawataki cake na veivakacacani ni veivakacacani (GLS) kei na veivakacacani ni veivakacacani 2 (GPT2) (itaba 3, A kei na C). E dodonu me da kila ni kena vakalawataki cake na GLS e vakaiyalayala ga ki na spliced ​​isoform glutaminase C (GLS-GAC) (na veisau ni Mfn2cKO / CTRL e rauta ni 4.5-vakaruataki, P = 0.05), kei na kena vakalawataki vakatabakidua ena veitiki ni yago ni kenisa E rawa ni tokona na mitochondrial. (27).
(A) Na mape ni katakata e vakaraitaka na veisau ni fold ena ivakatagedegede ni protein me baleta na sala vakatabakidua ena 8 na macawa. (B) ivakaraitaki ni dua na tiki ni cerebellar vakatakilakilataki ena veivakacacani ni PCx (ivakarau ni ivakarau, 20 μm). Na gasau dromodromo e dusia na yago ni sela ni Purkinje. (C) Na gauna ni vuli protein vakaraitaka na vakadidike e vakatakilakilataki me vaka e dua na tamata bibi me baleta na mate ni uto (vakatovotovo t-levu, * FDR <5%; n = 3-5 na kalavo). (D) E cake: E dua na iyaloyalo ni ituvatuva e vakaraitaka na sala duidui ni kena curu na kaboni vakatakilakilataki e tiko ena [1-13C] na dauvakadidike ni pyruvate (oya, ena PDH se sala ni trans-sala). Ena ruku: Na ituvatuva ni vaiolini e vakaraitaka na pasede ni dua-vakatakilakilataki na kaboni (M1) saumaki mai ki na asidi ni aspartic, asidi ni citric kei na asidi ni oti na kena vakatakilakilataki na veitiki ni cerebellar bibi kei na [1-13C] pyruvate (veiwatini t-vakatovolei; ** P <0.01). (E) Na vakadidike ni itukutuku ni gauna raraba ni sala e vakaraitaki. Vakasamataka ga na protein kei na P<0.05 ena 8 na macawa . Laini vakatikitiki: sega ni dua na isau ni veisau (rua na sala ni vakadidike ni veisau; * P <0.05; *** P <0.001). Na itukutuku e vakaraitaki me vaka na kena ibalebale ± SEM.
Ena noda vakadidike, sa yaco me dua vei ira na sala bibi ni kena vakalawataki na BCAA. Na dina oqo e vakaraitaka vakaukauwa ni na iwiliwili ni cagi e curu ki na veisau ni TCA e rawa ni veisau ena PN sega ni OXPHOS. Oqo e rawa ni matataka e dua na ivakarau levu ni rewiring ni metabolic ni uto, ka rawa ni dua na kena revurevu vakadodonu ena uto ni uto kei na bula ena gauna ni maroroi ni OXPHOS bibi ni cakacaka. Me salavata kei na vakasama oqo, keitou kunea ni PCx na enzyme ni veivakacacani levu e vakalawataki (Mfn2cKO / CTRL veisau e rauta ni 1.5 na gauna; itaba 3A), ka catalyzes na saumaki mai ni pyruvate ki na oxaloacetate (28), ka sa vakabauti ni tiko ena brain, 30). Me salavata kei na veika e rawati mai na proteomics, e vakaraitaka na veivakasarasarataki ni veivakasarasarataki ni PCx vakaraitaka vakatabakidua ka vakalevutaki vakalevu ena PNs ni OXPHOS-vakacacani, ni sa vakatabui vakalevu na veivakayarayarataki ni PCx ki na veitiki ni Bergmann glial ni lewa (irairai 3B). Me vakatovolei vakacakacaka na kena laurai na PCx, keitou a qarava na veitiki ni cerebellar bibi kei na [1-13C] na dauvakadidike ni pyruvate. Ni sa vakacacani na pyruvate mai na pyruvate (PDH), na kena ivakatakilakila ni isotope yali , Ia e vakacurumi ki na TCA veisautaki ni veimama ni gauna e vakayagataki kina na pyruvate ena veivakacacani ni vascular (iTaba 3D). Ena kena tokoni na noda itukutuku ni proteomics, keitou raica e dua na iwiliwili levu ni ivakatakilakila mai na tracer oqo ena aspartic ni asidi ni Mfn2cKO na tikitiki, ni asidi ni citric kei na asidi ni malic talega e tiko kina e dua na ivakarau ni veivakatautauvatataki, e dina ga ni sega ni bibi (iTaba 3D).
Ena veitiki ni yago ni MitoPark na kalavo kei na vakacacani ni yago e vakavuna na veitiki ni yago e vakarusa vakatabakidua na veitiki ni yago ni volavola e dua na gene (Tfam) (iTaba S6B), PCx vakaraitaka talega vakalevu cake-vakalawataki (31), e vakaraitaka ni acetone asidi dysfunction na du ni Na OKSIFOSI ena yago. E dodonu me da kila ni sa kunei ni duatani na enzymes (32-34) ka rawa ni vakaraitaki ena neurons ka rawa ni veiwekani kei na arteriosclerosis e vakalevutaki cake-vakalawataki ena PNs sega ni tiko ena OXPHOS, me vaka na propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA veisautaki ki na propionyl-CoA. enzyme 3 (ME3), na kena itavi levu duadua sai koya me vakabulai na pyruvate mai na malate (iTaba 3, A kei na C) (33, 35). Me kena ikuri, keitou kunea e dua na tubu levu ena Pdk3 ni veivakabulabulataki, ka phosphorylates ka vakakina na PDH (36), ni sega ni dua na veisau e laurai ena Pdp1 veivakabulabulataki ka vakayacora na PDH se na PDH veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki vakataki koya (itaba 3A). Tudei, ena Mern2cKO PNs, na phosphorylation ni α1 iwasewase α (PDHE1α) iwasewase lailai ni pyruvate dehydrogenase E1 iwasewase ni PDH vereverea ena Ser293 (kilai me vakataotaka na cakacaka ni enzyme ni PDH) a vakatorocaketaki ( itaba S6C) ( itaba S6C). E sega ni dua na sala ni dra.
Kena itinitini, keitou kunea ni sala ni super ni serine kei na glycine ni bula, na veiwekani ni mitochondrial folate (1C) kei na proline ni bula (itaba 1G kei na itaba S5C) era sa vakalevutaki kece cake-vakalawataki, me vaka na ripote, ena gauna ni cakacaka ni veivakabulabulataki. Na veitiki ni wavolita e vakacakacakataki ena vakacacani ni mitochondria (5-7). Na vakadidike ni veivakasama e tokona na itukutuku ni veivakabulabulataki oqo e vakaraitaka ni ena PN kei ​​na OXPHOS yali, na veitiki ni cerebellar ni kalavo ni 8 na macawa-yabaki era a vakayacori ki na 2 (SHMT2), e dua na enzyme bibi ni veisautaki ni folate ni mitochondrial. Na isau ni itataqomaki bibi (iTaba S5D). Ena 13 na CU-suka-vakatuburi na veitiki ni cerebellar bibi, na veivakatovolei ni vakatovotovotaki ni metabolic e vakadeitaka tale na kena vakalawataki cake na serine kei na proline, ka vakaraitaka ni sa tubu cake na flux ni isoforms ni kaboni ki na serine kei na proline (iTaba S5E). Me vaka ni veivakacacani e vakatorocaketaka na GLS kei na GPT2 e vakavuna na kena vakasoqoni vata na glutamate mai na glutamine kei na transamination ena maliwa ni glutamate kei na α-ketoglutarate, na nodra upregulation e vakaraitaka ni OXPHOS-vakacacani na neurons e tiko kina e dua na gagadre vakalevutaki me baleta na glutamate , Oqo e rawa ni kena inaki me maroroi kina na vakalevutaki ni proFig5). Ena kena veibasai na veisau oqo, e dua na vakadidike ni proteomic ni cerebellar astrocytes mai na PN-vakatabakidua Mfn2cKO kalavo e vakaraitaka ni sala oqo (oka kina na antiperoxidases kece) e sega ni veisau vakalevu ena vakaraitaka, vakaraitaka kina na veisautaki ni metabolic oqo ​​e digitaki me vakacacani PN (iVakaraitaki. S6).
Me vakalekalekataki, na vakadidike oqo e vakaraitaka na ivakarau duidui sara ni veivakabulabulataki vakayago ni sala ni metabolic vakatabakidua ena PNs. E dina ga ni sega ni dodonu na cakacaka ni mitochondrial ni neuronal e rawa ni vakavuna na mate ni uto kei na 1C vakavoui (itaba 3E kei na itaba S5C), kei na veisau sara mada ga e rawa ni tukuni ena kena vakaraitaki na veivakatorocaketaki ni au kei na IV, na veisau ni serine de novo synthesis e walega E a qai laurai ga ena sta ni oti. OXPHOS vakacacani (itaba 3E kei na itaba S5C). Na veika e kune oqo e vakamacalataka e dua na iwalewale ni veitarataravi ena kena sauma na lomaocaoca-vakavuna na mitochondrial (1C na veisau) kei na cytoplasmic (na veisautaki ni serine) kei na kena vakalevutaki na mate ni uto ena veisautaki ni TCA me vakavoutaka na veisautaki ni yago.
8-macawa-yabaki OXPHOS-vakacacani PNs e rawa ni maroroya na cakacaka ni veivakauqeti cecere-vakawasoma ka sotava na veivakavoui bibi ni metabolic me sauma na vakacacani ni mitochondrial. Na kunei oqo e laveta cake e dua na kena rawa ni taleitaki ni ena gauna mada ga oqo, na sela oqo e rawa talega ni Ciqoma na veiqaravi ni veivakabulabulataki me vakaberaberataka se tarova na neurodegeneration. Bera. Keitou walia na kena rawa oqo ena rua na veivuke tudei. Ena imatai ni iwalewale, keitou a vakarautaka e dua na Cre-vakararavi adeno-veiwekani na manumanu somidi (AAV) me rawa ni digitaki kina na MFN2 ena OXPHOS-sega ni PNs ena vivo (iTaba S7A). Na AAV encoding MFN2 kei na fluorescent dauvolaitukutuku ni gene mCherry (Mfn2-AAV) era a vakadeitaki ena itovo vakavanua ni neuron taumada ena vitro, ka vakavuna me vakaraitaki kina na MFN2 ena dua na ivakarau ni Cre-vakararavi ka vakabula na morphology ni mitochondrial, ka vakakina na kena tarovi na neuromutation ena Mfn, B itaba S2c7). Tarava, keitou vakayacora ena veivakatovolei ni vivo me vakadewataki vakatautauvata na Mfn2-AAV ni 8 na macawa ki na cerebellar ni Mfn2cKO kei na lewa ni kalavo, ka vakadikeva na kalavo ni 12 na macawa (itaba 4A). Na kalavo ni Mfn2cKO e qaravi e mate (itaba 1, A kei na B) (16). Na veisautaki ni manumanu somidi ena vivo e vakavuna na vakaraitaki digitaki ni PN ena so na ilawalawa ni cerebellar (iTaba S7, G kei na H). Na kena vakacurumi na AAV ni lewa vakaraitaka ga na mCherry (Ctrl-AAV) e sega ni dua na kena revurevu bibi ena ivakatagedegede ni vakacacani ni yago ena manumanu Mfn2cKO. Ena kena veibasai, na vakadidike ni Mfn2cKOs vakadewataki vata kei na Mfn2-AAV e vakaraitaka e dua na veitaqomaki bibi ni PN na sela ni tabana (itaba 4, B kei na C). Vakabibi, na kaukauwa ni neuron e vaka me voleka ni sega ni vakaduiduitaki rawa mai na manumanu ni lewa (itaba 4, B kei na C, kei na itaba S7, H kei na au). Na vakaraitaki ni MFN1 ia e sega ni MFN2 e tautauvata na kena yaga ena kena vakabulai na mate ni neuronal (itaba 4C kei na itaba S7, C kei na F), ka vakaraitaka ni vakaraitaki ni ectopic MFN1 e rawa ni vakavinakataka na lailai ni MFN2. Na vakadidike tale eso ena dua ga na ivakatagedegede ni PN e vakaraitaka ni Mfn2-AAV vakalevu sara na veivakabulai ni veitiki ni yago, vakatautauvatataki na ivakatagedegede ni mtDNA, ka vakasuka na vakaraitaka cecere ni ivakatakilakila ni veivakacacani ni PCx (itaba 4, C ki na E ). Na vakadidike ni mata ni vakabulai Mfn2cKO kalavo ena dua na ituvaki ni vakacegu e vakaraitaka ni nodra itutu kei na ivakatakilakila ni moto (toso S1 ki na S3) e vakavinakataki. Me kena itinitini, na veivakatovolei oqo e vakaraitaka ni vakaberaberataki ni kena vakacurumi tale na MFN2 ki na PNs vakalevu sara na kena lailai ena OXPHOS e rauta me vakasuka na vakayagataki ni mtDNA ka vakavuna na mate ni uto, ka tarova kina na vakacacani ni axon kei na mate ni neuronal ena vivo.
(A) E dua na ituvatuva e vakaraitaka na ituvatuva ni veivakatovolei me baleta na kena vakacurumi na AAV vakacurumi MFN2 ni sa vakayagataki na sala ni metabolic vakaraitaki. (B) Na iyaloyalo ni confocal ni mata ni 12 na macawa na veitiki ni cerebellar vakadewataki ena 8 na macawa ena kalavo ni Mfn2cKO ka vakatakilakilataki ena veivakacacani ni Calbindin. Matau: Na kena vakalevutaki na veitiki ni axon. Na ivakarau ni axon vakalevutaki e 450 kei na 75 μm. (C) Mawi: Vakatautauvatataki ni Purkinje na sela ni kaukauwa ena AAV ni veisautaki ni liga (AAV +) (dua na sala ni vakadidike ni veisau; n = 3 na kalavo). Matau: mtDNA vakasama ni vakadidike ena PN vakadewataki ena macawa 12 (sega ni veiwatini t-vakatovotovo; n = 6 na sela mai na tolu na kalavo). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Mata ni taranisimisani ni elekitironiki ni PNs ni Mfn2cKO iwasewase ni cerebellar vakadewataki vata kei na vectors ni manumanu somidi vakaraitaki. Na matavulo roka pink e vakaraitaka na vanua e taukena na dendrites, kei na dromodromo na sikivu e vakaraitaka na zoom e vakarautaki ena imatau; n e vakatakarakarataka na niukilia. Barra de escala, 1μm. (E) e vakaraitaka e dua na ivakaraitaki ni PCx vakacacani ena PN vakadewataki ena 12 na macawa. Barra de escala, 20 μm. OE, vakaraitaka vakasivia; FC, veisau ni veisau.
Kena itinitini, keitou vakadikeva na bibi ni bula ni sela ni peroxidase-vakavuna ena PNs ka sa sotava na OXPHOS vakacacani. Keitou vakatubura na mCherry vakacuruma na AAV-shRNA (RNA ni hairpin lekaleka) vakatabakidua na takete ni kalavo PCx mRNA (AAV-shPCx), ka vakacuruma na manumanu somidi se na kena lewa scrambled (AAV-scr) ki na cerebellum ni Mfn2cKO kalavo. Na veisele e vakayacori ena ikava ni macawa ni yabaki (itaba 5A) me rawati kina na PCx knockdown yaga ena gauna e tubu kina na PCx vakaraitaka (itaba 3C) kei na PN sela ni tabana e se tu ga (itaba 1A). E dodonu me da kila ni kena tukituki sobu na PCx (iTaba S8A) e vakavuna e dua na totolo levu ni mate ni PN, ka sa vakaiyalayala ga ki na mama e tauvimate (iTaba 5, B kei na C). Me rawa ni kilai na iwalewale ni veivakacacani ni metabolic e vakavuna na PCx cake-lawa, keitou vulica na ituvaki ni redox ni PNs ni oti na PCx tukituki kei na AAV-vakaveiwekanitaki na biosensor ni mata Grx1-roGFP2 era a vakaraitaki ena dua ga na gauna (iTaba S8, B ki na D) me vakalewai na glutathione ni Na veiwekani). Oti, keitou a vakayacora e rua na fotoni ni bula ni iyaloyalo ni iyaloyalo (FLIM) ena veitiki ni uto ni 7-macawa-makawa Mfn2cKO se lewa na littermates me raica na veisau e rawa ni yaco ena ituvaki ni redox ni oti na kena vakadeitaki na ituvaki ni FLIM (iTaba S8, E ki na G). Na vakadidike e vakaraitaka e dua na tubu levu ena ituvaki ni oxidation ni dua ga na Mfn2cKO PNs e sega na PCx vakaraitaka, ka sa duidui mai na neurons ni lewa se Mfn2cKO PNs vakaraitaka ga na shRNA vakacacani (itaba 5, D kei na E). Ni sa vakalailaitaki na ivakamacala ni PCx, na pasede ni Mfn2cKO PNs e vakaraitaka e dua na ituvaki ni oxidized cecere e tubu ena sivia na tolu na gauna (iTaba 5E), ka vakaraitaka ni PCx cake-vakalawataki e maroroya na redox rawa ni neurons vakacacani.
(A) E dua na ituvatuva e vakaraitaka na ituvatuva ni veivakatovolei me baleta na kena vakacurumi na AAV vakacurumi shPCx ni sa vakayagataki na sala ni metabolic vakaraitaki. (B) Na itaba ni confocal ni mata ni 8-macawa na iwasewase ni cerebellar ena Mfn2cKO kalavo vakadewataki ka vakatakilakilataki ena veivakacacani ni veivakacacani ena 4 na macawa. Barra de escala, 450 μm. (C) Na vakalevutaki ni Purkinje na sela ni kaukauwa ena AAV-vakadewataki na isema (dua na sala ni vakadidike ni veisau; n = 3 ki na 4 na kalavo). Na itukutuku e vakaraitaki me vaka na ibalebale ± SEM; ***P<0,001. (D) Mata FLIM iyaloyalo e vakaraitaka na ivakatautauvata ni bula ni 7-macawa-qase PN vakaraitaka na glutathione redox vakasama Grx1-roGFP2 ena ruku ni ituvaki ni veivakatovolei vakatabakidua. LUT (teveli ni rai-cake) ratio: gauna ni bula (ena picosekodi). Barra de escala, 25μm. (E) Na histogram e vakaraitaka na veiwasei ni Grx1-roGFP2 na bula ni bula mai na (D) (n = 158 ki na 368 na sela ena rua na kalavo ena ruku ni ituvaki yadua). Na ituvatuva ni pai e cake ni histogram yadua: e vakaraitaka na iwiliwili ni sela kei na vakaitamera balavu (damudamu, oxidized) se lekaleka (karakarawa, vakalailaitaki) na bula ni bula, ka sivia na 1 SD ni ivakatautauvata ni bula ni bula ena CTRL-AAV-scr. (F) Na ivakaraitaki vakaturi e vakaraitaka na veitaqomaki ni kena vakatorocaketaki na PCx ni neuronal.
Na veika kece, na itukutuku eda vakarautaka eke e vakaraitaka ni kena vakaraitaki tale na MFN2 e rawa ni vakabulai vakaoti na PN toso ki liu kei na leqa bibi ni OXPHOS, vakacacani ni mtDNA bibi, kei na morphology vakaitamera ni ista-me vaka na kena sega ni dodonu, ka vakarautaka kina na toso tomani tikoga ena mate sara mada ga ni toso ki liu. Na vakacacani ni uto e vakarautaka na ivakadinadina e rawa ni veisautaki ni ituvaki ni bera na mate ni sela. Na ivakatagedegede oqo ni veisau ni metabolic e vakabibitaki tale ena kena rawa ni vakavuna na neurons na mate ni uto (e dua na rewiring ni TCA ni veisau), ka vakatabuya na PCx vakaraitaka ena PNs sega ni OXPHOS ka vakalevutaka na mate ni sela, ka vakakina na kena vakayacori e dua na itavi ni veitaqomaki (iTaba 5F).
Ena vakadidike oqo, keitou vakarautaka na ivakadinadina ni kena saumi na PNs ki na OXPHOS sega ni cakacaka sa ikoya me vakalailaitaka vakamalua na TCA veisautaki ni veisautaki ni veisautaki ni veisautaki ni veisautaki ni veisautaki ni parokaramu ni metabolic. Keitou vakadeitaka na vakadidike ni proteomic ena vuqa na iwalewale ni veitokoni ka vakaraitaka ni gauna e vakatovolei kina na leqa bibi ni mitochondrial, na neurons e dua na ivakarau sega ni kilai taumada ni kaukauwa ni veisau. Me da kurabui, na iwalewale taucoko ni rewiring e sega ni dodonu me vakatakilakilataka na ituvaki ni metabolic ni icavacava ka lako vata kei na neurodegeneration vakamalua ka sega ni veisautaki rawa, ia na noda itukutuku e vakaraitaka ni rawa ni vakavuna e dua na neuron ni veivakabulabulataki ena gauna mada ga ni bera na mate ni sela Na iwalewale ni veivakadodonutaki ni cakacaka. Na ka e kune oqo e vakaraitaka ni neurons e dua na ivakatagedegede levu ni palasitika ni metabolic ena yago. Na dina oqo e vakadinadinataka ni kena vakacurumi tale e muri na MFN2 e rawa ni veisautaka na vakaraitaki ni ivakatakilakila bibi ni metabolic ka tarova na PN ni vakacacani. Kena veibasai, e tarova na mate ni salanidra qai vakatotolotaka na nerve. veimoceri vakatagane se vakayalewa.
E dua vei ira na veika e kunei vakasakiti duadua ena noda vakadidike sai koya na PNs e sega kina na OXPHOS e rawa ni veisautaka na veisautaki ni TCA ena kena vakatorocaketaki na enzymes ka vakavuna vakatabakidua na mate ni uto. Na veisautaki ni metabolic e dua na ivakarau tudei ni sela ni kenisa, eso vei ira era vakararavi ki na glutamine me vakaikuritaka na TCA veisautaki ni veimama me vakatubura na vakalailaitaki ni veivakatautauvatataki, ka draivataka na isema ni cegu ka maroroya na kena buli na lipid kei na niukilia ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki (39 , 40). E dua na vakadidike se qai oti toka ga e vakaraitaka ni ena veitiki ni yago e sotava tiko na OXPHOS, na kena vakacurumi tale na glutamine / glutamine e dua talega na ka kilai levu (5, 41), na vanua e vakatau kina na veidusimaki ni curu ni glutamine ki na veisautaki ni TCA ena Baleta na bibi ni mavoa ni OXPHOS (41). ). Ia, e lailai na ivakadinadina matata ena dua na tautauvata ni palasitika ni metabolic ni neuronal ena yago kei na kena rawa ni veiganiti ena ituvaki ni mate. Ena dua na vuli se qai oti toka ga ena vitro, a vakaraitaki na veitiki ni yago taumada me vakasoqona na tobu ni glutamate me baleta na veitiki ni yago, ka vakatorocaketaka kina na veisau ni yago kei na yago ni yago ena ruku ni ituvaki ni lomaocaoca ni yago (42). E dodonu me da kila ni ena ruku ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki, e vakabauti ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki (34). Ia, na kena veiganiti vakayago na iwalewale oqo ki na yago ni uto (na vanua e vakabauti kina ni dau vakatabui vakalevu na mate ni uto ki na astrocytes) e se tiko ga na kena bibi vakayago (43). Ena ituvaki oqo, na noda itukutuku e vakaraitaka ni PNs vakacacani mai na OXPHOS ena yago e rawa ni veisau ki na BCAA vakacacani kei na pyruvate carboxylation, ka sa rua na ivurevure levu ni ikuri ni TCA tobu ni veimama. E dina ga ni sa vakaturi na cau putative ni BCAA ki na kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa, me ikuri ni itavi ni glutamate kei na GABA me baleta na kaukauwa ni kaukauwa (44), e se bera tikoga ni dua na ivakadinadina me baleta na iwalewale oqo ena vivo. O koya gona, e rawarawa me vakasamataki ni PNs sega ni cakacaka e rawa ni vakasuka vakataki koya na kena vakayagataki na TCA veimama e vakavuna na iwalewale ni assimilation ena kena vakalevutaki na mate ni uto. Vakabibi, na kena vakatorocaketaki na PCx ena gadrevi me maroroi kina e dua na gagadre vakalevutaki me baleta na asidi ni aspartic, ka sa vakatututaki ena kena vakalevutaki na sela kei na vakacacani ni mitochondrial (45). Ia, na noda vakadidike ni metabolomics e sega ni vakaraitaka e dua na veisau bibi ena ivakatagedegede ni tudei ni asidi ena Mfn2cKO PNs (iTaba S6A), ka nanumi ni vakaraitaka na duidui ni vakayagataki ni asidi ena maliwa ni veivakatorocaketaki ni sela kei na neurons ni oti na mitotic . E dina ga ni iwalewale dodonu ni PCx upregulation ena veitiki ni yago ena vivo e se tikoga me vakatakilakilataki, keitou vakaraitaka ni saumi taro oqo e dua na itavi bibi ena kena maroroi na ituvaki ni redox ni veitiki ni yago, ka a vakaraitaki ena veivakatovolei ni FLIM ena veitiki ni cerebellar. Vakabibi, na kena tarovi na PNs mai na PCx cake-vakalawataki e rawa ni vakavuna e dua na ituvaki oxidized vakalevu cake ka vakatotolotaka na mate ni sela. Na vakavotukanataki ni BCAA vakacacani kei na carboxylation ni pyruvate e sega ni sala me vakatakilakilataki kina na veitiki ni yago ni veivakacacani ni veivakacacani (7). O koya gona, e vaka me ra sa dua na ka bibi duadua ni OXPHOS-sega ni rawata na neurons, kevaka mada ga e sega ni ka duadua ga, ka bibi me baleta na vakacacani ni uto. .
Na mate ni uto e dua na mataqali mate ni uto e dau vakaraitaki me vaka na ataxia ka dau vakacacana na PNs (46). Na iwiliwili ni neuron oqo e vakaleqai vakalevu sara ki na vakacacani ni mitochondrial baleta na nodra vakacacani digitaki ena kalavo e rauta me vakatubura e vuqa na ivakatakilakila ni moto ka vakatakilakilataka na ataxia ni tamata (16, 47, 48). Me vaka na itukutuku, e dua na ivakaraitaki ni mouse transgenic kei na dua na gene mutant e salavata kei na tamata spinocerebellar ataxia ka tiko kina na veivakacacani ni mitochondrial (49, 50), vakabibitaka na bibi ni kena vulici na veika e rawa ni yaco ena lailai ni OXPHOS ena PNPH. O koya gona, e veiganiti sara ga me vakavinakataki kina na kena vakatikitikitaki ka vulici na iwiliwili ni neuron duatani oqo. Ia, ni soli vei ira na PNs era sa rui vakaloloma ki na veivakasaurarataki ka vakavuna e dua na iwase lailai ni iwiliwili taucoko ni sela ni cerebellar, me baleta e vuqa na vakadidike yavutaki ena omics, digitaki ni veibiu vei ira me vaka na sela taucoko e se dua tikoga na tiki ni bolebole. E dina ga ni sa voleka ni sega ni rawa me rawati na lailai taucoko ni vakadukadukalitaki ni veimataqali sela tale eso (vakabibi na yago ni tamata qase), keitou a cokovata e dua na ikalawa ni veivakaduiduitaki yaga kei na FACS me rawati kina e dua na iwiliwili e rauta ni neurons bulabula me baleta na vakadidike ni proteomics sobu, ka sa cecere sara na kena vakarautaki na protein (me baleta na 3000) (51). Ena kena maroroi na bula rawati koya ni sela taucoko, na iwalewale eda vakarautaka eke e rawa kina vei keda me da sega walega ni raica na veisau ni sala ni metabolic ena mitochondria, ia me da raica talega na veisau ena kena veibasai ni cytoplasmic, ka vakataucokotaka na vakayagataki ni mitochondrial membrane tags ena mataqali sela ni tissuria Na iwalewale vou ni michond (52, 53). Na iwalewale eda vakamacalataka e sega walega ni semati ki na vuli ni Purkinje na sela, ia e rawarawa sara me vakayagataki ki na dua na mataqali sela me wali kina na veisau ni metabolic ena uto tauvimate, oka kina na ivakaraitaki tale eso ni mitochondrial dysfunction.
Kena itinitini, eda sa raica e dua na katubaleka ni veiqaravi ena gauna ni veisautaki ni metabolic oqo ​​ka rawa ni veisautaka vakaoti na ivakatakilakila bibi ni lomaocaoca ni sela ka tarova na vakacacani ni neuronal. O koya gona, na kila na ibalebale ni cakacaka ni rewiring e vakamacalataki eke e rawa ni vakarautaka na yavu ni vakasama ki na veiqaravi e rawa me baleta na maroroi ni bula ni neuronal ena gauna ni vakacacani ni mitochondrial. Na vakadidike ena veisiga ni mataka e kena inaki me dissecting na veisau ni kaukauwa ni metabolism ena so tale na mataqali sela ni uto e gadrevi me vakaraitaka taucoko na kena vakayagataki na ivakavuvuli oqo ki na mate tale eso ni uto.
Sa vakamacalataki oti na kalavo ni MitoPark (31). C57BL / 6N kalavo kei na loxP vakavolivolita na Mfn2 na kalavo sa vakamacalataki oti (18) ka kosova vata kei na kalavo L7-Cre (23). Na kena isau e rua na kawa heterozygous era sa qai vakacurumi vata kei na kalavo ni Mfn2loxP / Mfn2loxP me vakatubura na knockouts ni gene ni Purkinje-vakatabakidua me baleta na Mfn2 (Mfn2loxP / Mfn2loxP; L7-cre). Ena dua na iwasewase lailai ni veiwatini, na Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP allele (tu-mtYFP) a vakacurumi ena ikuri ni veicurumaki (20). Na veiqaravi kece ni manumanu e vakayacori me salavata kei na idusidusi ni Iurope, matanitu kei na isoqosoqo ka vakadonui mai vei ira na LandesamtfürNatur ni Umwelt kei Verbraucherschutz, Vualiku kei Rhine-Westphalia, Jamani. Na cakacaka ni manumanu e muria tale ga na veidusimaki ni isoqosoqo ni manumanu ni veisele e Iurope.
Ni oti na kena vakamatei na yago ni marama bukete, sa qai vakatikitikitaki na embryo ni kalavo (E13). Na cortex a vakacacani ena Hanks 'Masima vakatautauvatataki ni iwali (HBSS) vakaikuritaki ena 10 mM Hepes ka vakadewataki ena Dulbecco ni veisautaki ni ikeli ni veimaliwai e tiko kina na papain (20 U / ml) kei na cysteine ​​(1 μg / ml). Vakabulabulataka na yago ena DMEM) ka vakawabokotaka ena kena vakayagataki na enzymatic. Ml) ena 37°C me baleta na 20 na miniti, ka qai vakayagataki vakamisini ena DMEM vakaikuritaki ena 10% na dra ni bulumakau ni gone. Na sela era a vakatuburi ena iloilo ni veivakabulabulataki e ubi ena polylysine ena dua na kena levu ni 2 × 106 ena dua na 6 cm na kakana ni itovo vakavanua se ena dua na kena levu ni 0.5 × 105 na sela / cm2 me baleta na vakadidike ni iyaloyalo. Ni oti na 4 na auwa, na veimama a vakaisosomitaki ena veimama ni Neurobasal serum-galala e tiko kina na 1% B27 ikuri kei na 0.5 mM GlutaMax. Na neurons era sa qai maroroi ena 37°C kei na 5% CO2 ena gauna taucoko ni veivakatovolei, ka vakani vakadua ena dua na macawa. Me rawa ni vakavuna na veivakaduavatataki ena vitro, 3μl (24-vinaka na itovo vakavanua ni kakana) se 0.5μl (24-vinaka na peleti) ni vector ni manumanu somidi ni AAV9 oqo e vakayagataki me qaravi kina na neurons ena ikarua ni siga ena vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Ikuri, naba ni ivola 105530-AAV9) kei na AAV9.
Na kalavo Mfn1 kei na Mfn2 DNA veitokoni (rawati mai na Addgene plasmid # 23212 kei na # 23213, vakatautauvata) era sa vakatakilakilataki ena V5 na veitarataravi (GKPIPNPLLGLDST) ena C-itinitini, ka ra sa fused vata kei na mCherry ena ituvatuva ena veitarataravi ni T2A. Grx1-roGFP2 e dua na isolisoli mai vei Heidelberg TP Dick DFKZ. Ena kena sosomitaki na kaseti ni tdTomato ena kena vakayagataki na iwalewale ni cloning makawa, a subcloned na kaseti ki na pAAV-CAG-FLEX-tdTomato na sui ni daku (Addgene naba ni veidusimaki 28306) me vakatubura na pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFNGAV-V5, Vectores de páv-cag-flex-grx-rogfp2. E dua na iwalewale vata ga oqo e vakayagataki me vakatubura na vector ni lewa pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Me rawa ni vakatubura na AAV-shPCx tara, e dua na plasmid AAV vector (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- 3′) Ena ruku ni lewa ni U6 veivakatorocaketaki, mCherry e vakayagataki ena ruku ni lewa ni veivakatorocaketaki ni CMV. Na kena buli na veivuke ni AAV vectors a vakayacori me vaka na veidusimaki ni dau buli iyaya (Biolabs ni sela). Me vakalekalekataki, vakayagataka e dua na plasmid ni veisau kauta tiko na mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-Cag-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-Cag-FLEX-mCherry) vakalekaleka na veisautaki ni 29 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) se Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) na ivakatakilakila ni gene, ka vakakina na ivakatakilakila ni AAV1 capsid na protein kei na iyaya ni protein Vakavodoki ni plasmid ni plasmid, vakayagataki na iwalewale ni kalisiumi phosphate. Na kaukauwa ni manumanu somidi ni manumanu somidi a rawati mai na veisautaki ni vakacegu-vakacegu ena dua na aisi mamaca / ethanol kei na sela lysed ena phosphate vakasavasavataki (PBS). Na vector ni AAV a vakasavasavataki mai na veivakacacani ni veivakacacani ni veivakacacani (24 na auwa ena 32,000 rpm kei na 4°C) ka vakabibitaki ena kena vakayagataki e dua na veivakacacani ni veivakacacani ni Amicon. 2.9 × 1013 ilavelave ni genome (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX e vakarautaki me vaka e liu (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC/ml) kei na AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
Na neurons taumada era a vakasavasavataki ena aisi-batabata 1x PBS, pellets, ka qai vakatautauvatataki ena 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate / PBS lysis buffer e tiko kina na phosphatase kei na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki (Roche). Na vakarautaki ni protein e vakayacori ena kena vakayagataki na veivakatovolei ni asidi ni bicinchoninic (vakadidike ni dauqoli vakasaenisi). Era qai wasei na protein ena SDS-poliakrilamide gel vakalivaliva, ka qai vakasavasavataki ki na dua na iqaqalo ni livaliva (GE ni bula). Buloko na vanua e sega ni vakatabakidua ka vakasucuma vata kei na imatai ni veivakabulabulataki (raica na Teveli S1 me baleta na kena itukutuku matailalai) ena 5% na sucu ena TBST (Tris-vakabulabulataki saline vata kei na Tween), na ikalawa ni savasava kei na ikarua ni veivakabulabulataki ena TBST Vakabulabulataka. Vakabulabulataka na imatai ni veivakabulabulataki ena bogi ena +4°C. Ni oti na savasava, vakayagataka na ikarua ni antibody me baleta na 2 na auwa ena katakata ni rumu. E muri, ena kena vakacurumi na blot vata ga kei na dua na veivakacacani ni β-actin, a vakadeitaki na vakavodoki vata ga. Na kena kunei ena kena saumaki mai ki na kemikali kei na kena vakatorocaketaki na kemikali (GE ni veiqaravi ni bula).
Na veitiki ni yago era a vakatuburi taumada ena iubi ni iloilo era a vakadeitaki ena 4% paraformaldehyde (PFA) / PBS ena gauna vakarautaki ena ivakarau ni katakata ni rumu me baleta na 10 na miniti. Na coverslips e taumada ni vakasinaiti ena 0.1% Triton X-100 / PBS me baleta na 5 na miniti ena ivakarau ni katakata ni rumu, ka qai ena kena tarovi na buffer [3% na dra ni bulumakau (BSA) / PBS]. Ena ikarua ni siga, na coverslips era a savati ena buffer ni veivakabulabulataki ka vakacurumi ena veiganiti ni fluorophore-vakacurumi na ikarua ni veivakabulabulataki me baleta na 2 na auwa ena ivakarau ni katakata ni rumu; iotioti, na ivakaraitaki era a savati vakavinaka ena PBS vata kei na 4 ',6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) e vakacacani ka qai vakadeitaki ena slide ni maikorosikopu kei na Aqua-Poly / Ulunivanua.
Na kalavo (tagane kei na yalewa) era a vakamatei ena kena vakacurumi na ketamine (130 mg/kg) kei na xylazine (10 mg/kg) ka vakayagataki ena ruku ni kuliniyago kei na wainimate ni veivakalolomataki (5 mg/kg) , Ka biu ena dua na iyaya ni cakacaka ni kaukauwa (Kopd e dua na iyaya ni ivalu). Vakaraitaka na ulu ka vakayagataka e dua na drili ni bati me vakalailaitaka na tiki ni uto ni uto e veiganiti kei na sui ni mis (mai na lambda: iqaqalo 1.8, yasana 1, e veiganiti kei na lobules IV kei na V). Vakayagataka e dua na iqaqalo ni sikirini curved me vakavinakataki kina e dua na qara lailai ena ulu me kakua ni vakaleqa na vasculature e ra. Sa qai vakacurumi vakamalua na capillary bilo dregati manifinifi ki na qara lailai (mai -1.3 ki na -1 ena yasa ni ventral ni dura mater), kei na 200 ki na 300 nl AAV e vakacurumi ki na micro-injector (Narishige) kei na sirinji ni ivola (Narishige tisure) gauna ni sever100. miniti ni katubaleka. Ni oti na kena vakayagataki, biuta na capillary me 10 tale na miniti me rawa kina ni tete vakaoti na manumanu somidi. Ni sa kau tani na veisala ni dra, e dau sutu vinaka na kuliniyago me vakalailaitaka na vuvuce ni mavoa qai rawa kina vua na manumanu me vakabulabula tale. Era a qaravi na manumanu ena wainimate ni mosi (caspofen) me vica na siga ni oti na veisele, ena gauna oqori e a dikevi vakavinaka kina na nodra ituvaki vakayago ka ra qai vakamatei ena gauna e tukuni. Na iwalewale kece e vakayacori me salavata kei na idusidusi ni Iurope, matanitu kei na isoqosoqo ka vakadonui mai vei ira na LandesamtfürNatur ni Umwelt kei na Verbraucherschutz, Vualiku kei Rhine-Westphalia, Jamani.
Na manumanu era a vakamatei ena ketamine (100 mg / kilokaramu) kei na xylazine (10 mg / kilokaramu), kei na uto e a vakasinaiti ena 0.1 M PBS taumada, ka qai 4% PFA ena PBS. Na yago e a vakacacani ka vakadeitaki ena 4% PFA / PBS ena bogi ena 4 ° C. E dua na iseleiwau vibrating (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Ositerelia) a vakayagataki me vakarautaki kina na iwasewase ni sagittal (50 μm na kena rabailevu) mai na uto tudei ena PBS. Vakavo ga ke vakaraitaki vakatani, staining ni veitiki ni galala-vakacacani a vakayacori me vaka e vakamacalataki e cake (13) ena katakata ni rumu kei na veivakauqeti. Me vakalekalekataki, imatai, na veitiki ni rawati era a vakacurumi ena 0.5% Triton X-100 / PBS me baleta na 15 na miniti ena ivakarau ni katakata ni rumu; me baleta eso na epitopes (Pcx kei na Shmt2), ena ena tris-EDTA buffer ena 80 ° C (PH 9) katakata na veitiki me baleta na 25 na miniti me isosomi ni ikalawa oqo. Tarava, na veiwase era a vakasucumi vata kei na imatai ni antibody (raica na Teveli S1) ena kena tarovi na buffer (3% BSA / PBS) ena 4 ° C ena bogi taucoko kei na veivakauqeti. Ena siga ka tarava, na veiwase era a savati ena buffer ni veivakabulabulataki ka vakacurumi vata kei na veiganiti ni fluorophore-vakacurumi na ikarua ni veivakabulabulataki me baleta na 2 na auwa ena ivakarau ni katakata ni rumu; iotioti, na veiwase era a savati vakavinaka ena PBS, vakacacani-vakacacani ena DAPI, ka qai vakadeitaki ena AquaPolymount Ena dua na iyaloyalo ni misini lailai.
E dua na laser scanning confocal microscope (TCS SP8-X se TCS digitaki rarama pepa, Leica Microsystems) vakaiyaragitaki ena dua na laser vulavula kei na dua na 405 diode ultraviolet laser a vakayagataki me iyaloyalo ni ivakaraitaki. Ena kena vakamarautaki na fluorophore kei na kena kumuni na sikinala vata kei na Hybrid Detector (HyDs), a vakayagataki na parokaramu ni komipiuta ni LAS-X me kumuni kina na iyaloyalo vakatautauvatataki me salavata kei na ivakaraitaki ni Nyquist ena ivakarau ni veitarataravi: me baleta na ilawalawa sega ni vakatautauvatataki, sa rui kaukauwa sara na sikinala (me kena ivakaraitaki, ena sela ni somatic kei na dendrites) mt ivakarau ni R rarama). Gating mai na 0.3 ki na 6 ns e vakayagataki me vakalailaitaka na itukutuku.
Na gauna dina ni iyaloyalo ni sela vakarautaki. Ni oti na kena vakarautaki ena Neurobasal-E dua na veimaliwai e tiko kina na 1% B27 ikuri ni kei na 0.5 mM GlutaMax, era a vakatuburi sara na sela ena poly-l-lysine-coated na iloilo ni iloilo (μ-Slide8 Vinaka, Ibidi, na naba ni katakata 80826) , Ka qai maroroya ena dua na ho°C ki na 300. me vakaitikotiko. Na gauna dina ni iyaloyalo a vakayacori ena dua na Leica SP8 laser vakadidike confocal na misini lailai vakarautaki ena dua na laser vulavula, HyD, 63 × [1.4 na matailoilo ni nabavuni (NA)] waiwai ni inaki ni matailoilo kei na dua na ivakatagedegede ni vakatakatari.
Na kalavo a totolo sara na kena vakamatei ena kaboni daiokisaiti ka musuki, na uto a totolo sara na kena kau tani mai na ulu, ka musuki ki na 200μm na kena rabailevu (me baleta na 13C vakatovotovo ni vakatakilakilataki ni Fisher) se 275μm na rabailevu (me baleta na rua na vakatovotovo ni photon) iwasewase sagittal vakasinaiti ena veika oqo cremo Na V-500). Vakasaenisi, Walldorf, Jamani) e vakasinaiti ena veika oqo: 125 mM aisi-batabata, kaboni-vakasinaiti (95% O2 kei na 5% CO2) lailai Ca2 + wai cerebrospinal buli (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium pho2. suka, 0,5 mm CaCl2 y 3,5 mm MgCl2 (presión osmótica de 310 a 330 mmol). Tosoya na veitiki ni uto e rawati ki na dua na rumu ni bera na vakasucu e tiko kina na Ca2 + ACSF cecere (125.0 mM Nacl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-suka, 25.0 mM d-suka. MgCl2) Veimama) pH 7,4 kei na 310 ki na 320 mmol).
Ena gauna ni iyaloyalo, na veitiki era a toso ki na dua na rumu ni iyaloyalo vakatabui, kei na veivakatovolei e vakayacori ena ruku ni tomani tikoga ni ACSF perfusion ena dua na ivakarau ni katakata tudei ni 32° ki na 33°C. E dua na leisa ni vakadidike ni multiphoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) vakaiyaragitaki ena dua na matailoilo ni inaki ni Leica 25x (NA 0.95, wai), Ti: Leisa ni safaia (Raivotu ni Chameleon II, Coherent) a vakayagataki me baleta na iyaloyalo ni tikitiki. Módulo de FLIM (picoharp300, picocuanto).
FLIM ni Grx1-Rogfp2. Na veisau ena ituvaki ni redox ni PNs a vakarautaki ena rua na fotoni FLIM ena veitiki ni uto ni sagittal, na vanua e taketetaki kina na PNs na Grx1-roGFP2. Ena tabana ni PN, na vanua ni rawati e digitaki me baleta na 50 ki na 80 μm ena ruku ni dela ni tiki me vakadeitaka ni tiko e dua na PN bulabula (o ya, na lailai ni ituvatuva ni beaded se veisau ni morphological ni neuronal ena dendrites) kei na vakaruataki ni roGFP2 vinaka ni vakasama kei na PCx mCeri). Soqona na iyaloyalo ni dua ga na ituvatuva kei na 2x vakalevutaki digitaki [vakauqeti ni galu: 890 nm; 512 nm 512 na iyaloyalo]. Vakadikevi: HyD ni loma, ilawalawa ni vakasavasavataki ni fluorescein (FITC) kei na iyaloyalo ni vakatautauvatataki ena loma ni 2 ki na 3 na miniti e vakayagataki me vakadeitaka ni sa rauta na photons era kumuni (1000 na photons ena kena levu) me baleta na veiganiti ni curve. Na vakasama ni Grx1-roGFP2 vakadidike kei na vakadeitaki ni ituvaki ni FLIM a vakayacori ena kena dikevi na yaga ni bula ni roGFP2 ena gauna e vakacurumi kina na exogenous 10 mM H2O2 ki na ACSF ni veivakabulabulataki (me vakalevutaki na oxidation, ka vakavuna na kena vakalevutaki na bula ni veivakadonui). vakalailaitaki, ka vakavuna na kena vakalailaitaki na bula) (iTaba S8, D ki na G). Vakayagataka na FLIMfit 5.1.1 parokaramu ni komipiuta me dikevi kina na veika e rawati, veiganiti kei na dua ga na curve ni vakacacani ni iyaloyalo taucoko ki na IRF vakarautaki (cakacaka ni isau ni iyaya ni cakacaka), kei na χ2 e rauta ni 1. Me vakarautaki na bula ni dua ga na PN, na matavulo a manually bula wavolita na nerve . vakayagataki me baleta na kena vakarautaki.
Na vakadidike ni rawa ni mitokondria. Ni oti na iwasewase ni kaukauwa e a vakasucumi ena 100 nM TMRM vakadodonu me vakacurumi ki na ACSF vakasavasavataki me baleta na 30 na miniti, na veisau ni rawa ni mitochondrial ni PNs a vakarautaki ena dua na misini ni vakadidike e rua na photon. TMRM iyaloyalo a vakayacori ena kena vakamarautaki na vakadidike ena 920 nm ka vakayagataka na HyD ni loma (585/40 nm) me kumuni kina na sikinala; ena kena vakayagataki na kaukauwa ni veivakauqeti vata ga ia e vakayagataki e dua na HyD duidui ni loma (FITC :525/50) me iyaloyalo mtYFP. Vakayagataka na ImageJ ni iyaloyalo ni vakasama ni vakasama me vakalewai na rawa ni mitochondrial ena dua ga na ivakatagedegede ni sela. Me vakalekalekataki, na ivakarau ni plug-ena: ivakatakilakila = min (mtYFP, TMRM) e vakayagataki me kilai kina na vanua ni mitochondrial e vakaraitaka na ivakatakilakila ni TMRM ena Purkinje Somali ena iyaloyalo confocal ni dua-stack ni sala veiganiti. Sa qai vakarautaki na vanua ni pixel ena iubi ni mata e rawati, ka qai vakatautauvatataki ena veiganiti ni katubaleka dua-ivakarau ni iyaloyalo ni mtYFP me rawati kina na iwasewase ni mitochondrial e vakaraitaka na rawa ni mitochondrial.
Na iyaloyalo e a vakayagataki ena parokaramu ni komipiuta ni Huygens Pro (Iyaloyalo ni iVola Vakasaenisi). Me baleta na iyaloyalo ni vakadidike ni tile, na montage ni dua ga na tile e caka ena kena vakayagataki na ivakarau ni culacula vakataki koya e vakarautaka na parokaramu ni komipiuta ni LAS-X. Ni oti na vakatautauvatataki ni iyaloyalo, vakayagataka na ImageJ kei na Adobe Photoshop me vakavinakataki tale kina na iyaloyalo ka vakatautauvatataki na kena rarama kei na kena veibasai. Vakayagataka na Adobe iyaloyalo me baleta na vakavakarau ni iyaloyalo.
mtDNA vakasama ni vakadidike. Na iwiliwili ni mtDNA na mavoa e vakarautaki ena veitiki ni cerebellar vakatakilakilataki ena veivakabulabulataki ni DNA ena veivakabulabulataki ni confocal. Na vanua yadua ni takete e buli me baleta na yago ni sela kei na nucleus ni sela yadua, kei na vanua yadua e vakarautaki ena kena vakayagataki na plug-ena Multi ivakarau (ImageJ parokaramu ni komipiuta). Kauta laivi na vanua ni niukilia mai na vanua ni yago ni sela me rawati kina na vanua ni cytoplasmic. Kena itinitini, na Vakadikeva na veitiki ni plug-ena (ImageJ parokaramu ni komipiuta) a vakayagataki me vakarautaka vakataki koya na veitiki ni DNA ni cytoplasmic e vakaraitaka na mtDNA ena iyaloyalo ni katubaleka, kei na veika e rawati e vakatautauvatataki ki na ivakarau ni PN ni CTRL na kalavo. Na kena isau e vakaraitaki me vaka na ivakatautauvata ni iwiliwili ni niukilia ena dua na sela.
Na vakadidike ni vakaraitaki ni protein. Vakayagataka na ImageJ ni iyaloyalo ni vakasama ni plug-ena me vakalewai na ivakaraitaki ni protein ena PN ena dua ga na ivakatagedegede ni sela. Me vakalekalekataki, ena dua ga na iyaloyalo ni confocal ni sala veiganiti, ena veivakatautauvatataki: sikinala = min (mtYFP, veivakabulabulataki), na vanua ni mitochondrial e vakaraitaka na veivakabulabulataki ki na dua na veivakabulabulataki ena Purkina e vakatakilakilataki. Sa qai vakarautaki na vanua ni pixel ena iubi ni mata e rawati, ka qai vakatautauvatataki ena iyaloyalo ni dua-na-itutuvi ni sala ni mtYFP me rawati kina na iwasewase ni mitochondrial ni protein vakaraitaki.
Na vakadidike ni kaukauwa ni sela ni Purkinje. Na plug-in ni wiliwili ni sela ni ImageJ a vakayagataki me vakalewai na Purkinje na kena levu ena kena wasei na iwiliwili ni sela ni Purkinje e wiliki ena balavu ni mama ni cerebellar e taukena na sela wiliwili.
Vakarautaki ni ivakaraitaki kei na kena kumuni. Na uto mai na ilawalawa ni lewa kei na kalavo ni Mfn2cKO era a vakadeitaki ena 2% PFA / 2.5% glutaraldehyde ena 0.1 M phosphate buffer (PB), ka qai vakarautaki na iwasewase ni coronal ena kena vakayagataki na ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Vakadodonutaki ni 50 ki na 600) tetraoxide kei na 1.5% potasiumi ena ivakarau ni katakata ni rumu me baleta na 1 na auwa. Na veiwase era a savati vakatolu ena wai vakasavasavataki, ka qai vakasinaiti ena 70% ethanol e tiko kina na 1% uranyl acetate me baleta na 20 na miniti. Na veiwase era sa qai vakamamacataki ena alakaolo vakarautaki ka vakacurumi ena Durcupan ACM (Araldite vakalialia na resin M) epoxy resin (saenitisi ni Microscopy vakalivaliva, naba ni ivolatukutuku 14040) ena maliwa ni silikoni-coated bilo slides, ka kena itinitini ena 60 ° C Polymerize ena ovani. Na vanua ni cerebellar cortex a digitaki ka 50 nm na iwasewase ultrathin era a musuki ena Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Ositerelia) ka digitaki ena dua na 2 × 1 mm na kopa ni slit grid e ubi ena iyaloyalo ni polystyrene. Na veiwase era a vakacacani ena dua na iwali ni 4% uranyl acetate ena H2O me baleta na 10 na miniti, savati ena H2O ena vica na gauna, qai ena Reynolds iliuliu citrate ena H2O me baleta na 10 na miniti, ka qai savati ena H2O ena vica na gauna. Micrographs a tauri vata kei na dua na taranisimisani elekitironiki maikorosikopu Philips CM100 (Thermo dauqoli vakasaenisi, Waltham, MA, Amerika) vakayagataka e dua na TVIPS (Tietz vidio kei na iyaloyalo ni ivakarau ni cakacaka) TemCam-F416 iyaloyalo digitaki (TVIPS GmbH, Gauting, Amerika). Jamani).
Me baleta na kalavo e tauvi AAV, na uto e wasei ka vakatikitikitaki ki na dua na iwasewase ni sagittal 1 mm na kena rabailevu, ka vakadikevi na cerebellum ena kena vakayagataki e dua na misini ni vakadidike me kilai kina na mama e tauvi AAV (o ya, mCherry vakaraitaka). Na veivakatovolei ga ena kena vakayagataki na AAV ni veisele e dua na kaukauwa cecere sara ni veisautaki ni Purkinje na sela ni sela (oya ni voleka ni taucoko ni sela) ena lailai duadua e rua na mama ni cerebellar veitaravi e vakayagataki. Na AAV-vakadewataki na iqaqalo e a vakalailaitaki me baleta na bogi ni oti na vakadeitaki (4% PFA kei na 2.5% glutaraldehyde ena 0.1 M koko ni buffer) ka vakayacori tale. Me baleta na EPON embedding, na yago tudei a savati ena 0.1 M na wai ni koko ni sodium (Applichem), ka vakatuburi ena 2% OsO4 (os, Veiqaravi ni Saiensi; Caco) ena 0.1 M na wai ni koko ni sodium (Applichem) 4 na auwa, qai savati me baleta na 2 na auwa. Tokaruataka 3 na gauna kei na 0.1 M ni veivakabulabulataki ni kokamide. E muri, na veitarataravi ni ethanol e cake e vakayagataki me vakatubura na iwali ni ethanol yadua ena 4°C me baleta na 15 na miniti me vakamalumalumutaka na yago. Na yago a vakadewataki ki na propylene oxide ka vakatuburi ena bogi taucoko ena EPON (Sigma-Aldrich) ena 4°C. Biuta na tissue ena EPON vou ena katakata ni rumu me baleta na 2 na auwa, ka qai vakacuruma ena 62°C me baleta na 72 na auwa. Vakayagataka e dua na ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) kei na dua na isele ni daimani (Diatome, Biel, Suwitisiladi) me musuki kina na 70 nm ultrathin iwasewase, ka vakadukadukalitaka na 1.5% uranyl acetate me baleta na 15 na miniti ena 37 ° C, ka vakadukadukalitaka na iwali ni citrate ni iliuliu 4 na miniti. Na iyaloyalo lailai ni elekitironiki era a tauri ena kena vakayagataki e dua na JEM-2100 Vakacuruma na taranisimisani ni iyaloyalo lailai ni elekitironiki (JEOL) vakarautaki ena iyaloyalo ni dua na rai 4K 16-tikina (Gatan) kei na parokaramu ni komipiuta ni DigitalMicrograph (Gatan). Me baleta na vakadidike, era a rawati na iyaloyalo lailai ni elekitironiki ena 5000 × se 10,000 × digitaki ni digitaki.
Na vakadidike ni bula ni mitokondria. Me baleta na veivakatarogi kece, na veitarataravi ni veitiki ni yago yadua era a vakamacalataki ena liga ena iyaloyalo digitaki ena kena vakayagataki na parokaramu ni komipiuta ni ImageJ. E vakadikevi na veimataqali ivakarau ni bula. Na levu ni mitochondria e vakaraitaki me vaka e dua na pasede e rawati ena kena wasei na iwiliwili taucoko ni vanua ni mitochondria ni veisela yadua ena vanua ni veisele (vanua ni veisele = vanua ni sela-vanua ni niukilia ni sela) × 100. Na roundness ni veisele e vakarautaki ena fomula [4π∙2(vanua)/perimeter]. Na ista ni ibulibuli ni mitochondria e vakadikevi ka wasei ki na rua na iwasewase (“tubular” kei na “bulibuli”) me vaka na nodra ibulibuli levu.
Na iwiliwili ni autofagosoma/lisosoma kei na vakadidike ni densidad. Vakayagataka na parokaramu ni komipiuta ni ImageJ me vakamacalataka vakataki iko na veitarataravi ni veitiki yadua ni iyaloyalo digitaki. Na vanua ni autofagosome / lysosome e vakaraitaki me vaka e dua na pasede e vakarautaki ena kena wasei na iwiliwili taucoko ni autofagosome / lysosome na vanua ni ituvatuva ni veisele yadua ena vanua ni veisele (vanua ni veisele = vanua ni sela-vanua ni niukilia) × 100. Na levu ni veitiki ni yago e vakarautaki ena kena wasei na iwiliwili taucoko ena iwiliwili ni veitiki ni yago/veitiki ni yago ena dua na sela (ena kena vakayagataki na vanua ni veitiki ni yago) (vanua ni veitiki ni yago = vanua ni sela-vanua ni niukilia).
Na vakatakilakilataki me baleta na veiwasei ni acute kei na vakavakarau ni ivakaraitaki. Me baleta na veivakatovolei e gadrevi kina na vakatakilakilataki ni suka, tosoya na veitiki ni uto bibi ki na dua na rumu ni bera na vakasucu, ka tiko kina na kaboni vakasinaiti (95% O2 kei na 5% CO2), cecere na Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate. 25.0 mM d-suka, 1.0 mM CaCl 2 kei na 2.0 mM MgCl 2, vakadodonutaki ki na pH 7.4 kei na 310 ki na 320 mOsm), ena kena suka e 13 C 6- Veisosomitaki ni suka (Eurisotop, naba ni ivolatukutuku CLM9-1). Me baleta na veivakatovolei e gadrevi kina na vakatakilakilataki ni pyruvate, vakadewataka na veitiki ni uto bibi ki na Ca2 + ACSF cecere (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-suka kei na MgCl2, vakadodonutaka ki na pH 7.4 kei na 310 ki na 320mOsm), ka vakuria na 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, naba ni ivolatukutuku CLM-1082). Vakabulabulataka na veiwase me 90 na miniti ena 37°C. Ena icavacava ni vakatovotovo, na veiwase era sa totolo sara na kena savati ena dua na iwali ni wai (pH 7.4) e tiko kina na 75 mM amonium carbonate, ka qai homogenized ena 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): methanol: wai. Ni oti na veiwase era sa vakasucumi ena aisi me baleta na 30 na miniti, na ivakaraitaki era a vakasucumi ena 21,000 g me baleta na 10 na miniti ena 4 ° C, kei na supernatant matata e vakamamacataki ena dua na vakasama ni SpeedVac. Na peleti ni metabolite mamaca e rawati e maroroi ena -80°C me yacova na vakadidike.
Na vakadidike ni wai-levu ni 13 C-vakatakilakilataki amino asidi. Me baleta na vakadidike ni wai-levu ni wai (LC-MS), na peleti ni metabolite a vakasukai tale ena 75 μl ni wai ni kalasi ni LC-MS (Oni). Ni oti na vakasavasavataki ena 21,000 g me baleta na 5 na miniti ena 4 ° C, 20 μl ni vakasaqaqara vakamatatataki a vakayagataki me baleta na vakadidike ni flux ni amino asidi, ni vo ni vakasaqaqara e vakayagataki sara ga me baleta na vakadidike ni anion (raica e ra). Na vakadidike ni amino asidi e vakayacori ena kena vakayagataki na ivakarau ni vakatubuilavo ni vakatubuilavo sa vakamacalataki oti (55, 56). Ena imatai ni ikalawa, 10μl ni 100 mM sodium carbonate (Sigma-Aldrich) a vakuri ki na 20μl ni metabolite vakasavasavataki, ka qai 10μl ni 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) a vakuri ki na LC kalaji ACN. Na ivakaraitaki e vortexed vakalekaleka ka qai vakadrodroi ena 21,000 g me baleta na 5 na miniti ena 20 ° C. Tosoya na vakasavasavataki ni vakasavasavataki ki na dua na 2 ml na tavaya ni autosampler vata kei na dua na bilo conical vakacurumi (200 μl na iwiliwili). Na ivakaraitaki era a vakadikevi ena kena vakayagataki na ivakarau ni LC cecere ni cakacaka ni rawa-ka iClass (Wai) e semati ki na Q-vakadodonutaki (QE)-HF (Orbitrap ni vanua cecere) cecere-vakatulewa dodonu ni spectrometer ni levu (Thermo dauqoli vakasaenisi). Me baleta na vakadidike, 2μl ni ivakaraitaki ni vakadewataki a vakacurumi ki na dua na 100 × 1.0 mm cecere-kaukauwa silika T3 duru (Wai) e tiko kina na 1.8μm na tikitiki. Na ivakarau ni drodro e 100μl/min, kei na ivakarau ni veivakabulabulataki e tiko kina na veivakabulabulataki A (10 mM amoniumi kei na 0.15% asidi ni fomiki ena wai) kei na veivakabulabulataki B (ACN). Na kena ivakarau e vakaoqo: 0%B ena 0 na miniti; 0%B. 0 ki na 15% B ena 0 ki na 0.1 na miniti; 15 ki na 17% B ena 0.1 ki na 0.5 na miniti; B ena 17 ki na 55% ena 0.5 ki na 14 na miniti; B ena 55 ki na 70% ena 14 ki na 14.5 na miniti; ena 14.5 ki na 70 ki na 100% B ena 18 na miniti; 100% B ena 18 ki na 19 na miniti; 100 ki na 0% B ena 19 ki na 19.1 na miniti; 0% B ena 19.1 ki na 28 na miniti (55, 56). Na QE-HF levu spectrometer cakacaka ena ivakarau ni ionization vinaka kei na dua na levu ni m/z (levu/iwiliwili ni isau) ni 50 ki na 750. Na vakatulewa e vakayagataki e 60,000, kei na rawa-ka ni lewa (AGC) takete ni ion e rawati e 3 × 106, kei na gauna ni ion levu duadua e milli0conds. Na ivurevure ni ionization ni electrospray katakata (ESI) e cakacaka ena dua na kaukauwa ni spray ni 3.5 kV, e dua na ivakarau ni katakata ni capillary ni 250°C, e dua na cagi ni sheath ni 60 AU (iuniti ni arbitrary), kei na dua na cagi ni veivuke ni 20 AU. 250°C. Na matailoilo S e vakarautaki ki na 60 AU.
Na vakadidike ni anion-MS ni 13C vakatakilakilataki na asidi ni veika bula. Na vo ni metabolite ni vakacaca (55 μl) a vakadikevi ena kena vakayagataki e dua na ivakarau ni veivakabulabulataki ni ion ni Dionex (ICS 5000 +, Vakasaenisi ni dauqoli katakata) e semati ki na dua na QE-HF vakasaenisi ni dauqoli levu (vakasaenisi ni dauqoli katakata). Me vakalekalekataki, 5μl ni metabolite lavetaki a vakacurumi ki na dua na duru ni Dionex IonPac AS11-HC vakaiyaragitaki ena HPLC (2 mm × 250 mm, levu ni tikitiki 4μm, Thermo Fisher vakasaenisi) ena toso-ena ivakarau ni loop vakatikina kei na dua na ivakarau ni vakasinaiti ni 1. 4μm, Vakasaenisi ni dauqoli katakata). Na ivakarau ni duru e maroroi tiko ena 30 ° C, kei na autosampler e vakarautaki ki na 6 ° C. Vakayagataka e dua na kato ni potasiumi vakarautaki ena wai deionized me vakatubura e dua na potasiumi ni vakatubuilavo ena kena vakayagataki na eluent. Veitawasei ni veisau ena dua na ivakarau ni drodro ni 380μl/min, vakayagataka na gradient oqo: 0 ki na 3 na miniti, 10 mM KOH; 3 ki na 12 na miniti, 10 ki na 50 mM KOH; 12 ki na 19 na miniti, 50 ki na 100 mM KOH; 19 ki na 21 na miniti , 100 mM KOH; 21 ki na 21.5 na miniti, 100 ki na 10 mM KOH. Na duru e a vakatautauvatataki tale ena ruku ni 10 mM KOH me baleta na 8.5 na miniti.
Na veivakabulabulataki eluted era sa cokovata kei na dua na 150μl / min isopropanol ikuri ni uciwai ni oti na duru ka qai vakadodonutaki ki na dua na ivakatagedegede cecere ni vakatulewa ni cakacaka ena ivakarau ni ionization ca. MS e vakaraica tiko na levu ni veimataqali mai na m/z 50 ki na 750 kei na dua na vakatulewa ni 60,000. Na AGC e vakarautaki ki na 1 × 106, kei na gauna ni ion levu duadua e maroroi tu ena 100 ms. Na ivurevure ni ESI katakata e vakayagataki ena dua na kaukauwa ni spray ni 3.5 kV. Na ituvatuva tale eso ni ivurevure ni ion e vakaoqo: na ivakarau ni katakata ni capillary 275°C; drodro ni kasi ni vatu, 60 AU; veivuke ni kasi drodro, 20 AU ena 300°C, kei na S matailoilo ni ituvatuva ki na 60 AU.
Na vakadidike ni itukutuku ni 13C vakatakilakilataki na veisau. Vakayagataka na parokaramu ni komipiuta ni TraceFinder (ivakadewa 4.2, Vakasaenisi ni dauqoli katakata) me baleta na vakadidike ni itukutuku ni isotope ratio. Na ivakatakilakila ni veimataqali yadua e vakadeitaki ena dua na veimataqali veivakadeitaki nuitaki ka vakadikevi vakataki koya. Me rawa ni vakayacori kina na vakadidike ni vakavutuniyautaki ni isotope, na vanua ni kena lavetaki na ion chromatogram (XIC) ni isotope yadua ni 13C (Mn) a lavetaki mai na [M + H] +, na vanua e n na naba ni kaboni ni takete ni veivakaduavatataki, vakayagataki me vakadikevi kina na amino acid se [ MH ] + e vakayagataki me vakadikevi kina na anions. Na dodonu ni levu ni XIC e lailai mai na lima na iwase ena dua na milioni, kei na dodonu ni RT e 0.05 na miniti. Na vakadidike ni vakavutuniyautaki e vakayacori ena kena vakarautaki na ratio ni isotope yadua e kunei ki na isoqoni ni isotopes kece ni veivakaduavatataki veiganiti. Na veivakatautauvatataki oqo e soli me vaka na pasede ni isau ni isotope yadua, kei na kena isau e vakaraitaki me vaka na molar pasede ni vakavutuniyautaki (MPE), me vaka e vakamacalataki taumada (42).
Na peleti ni neuron batabata a vakatautauvatataki ena aisi-batabata 80% methanoli (v / v), vakasavasavataki, ka vakatuburi ena -20 ° C me baleta na 30 na miniti. Vortex tale na ivakaraitaki ka vakamamacataka ena +4°C me baleta na 30 na miniti. Na ivakaraitaki e a vakadrodroi ena 21,000 g me baleta na 5 na miniti ena 4 ° C, ka qai vakasoqoni vata na kena isau ka vakamamacataki ena kena vakayagataki e dua na vakasama ni SpeedVac ena 25 ° C me baleta na vakadidike e tarava. Me vaka e vakamacalataki mai cake, a vakayacori na vakadidike ni LC-MS ena amino ni veisele vakarautaki. Vakayagataka na TraceFinder (ivakadewa 4.2, Vakasaenisi ni dauqoli ni katakata), a vakayacori na vakadidike ni itukutuku ena kena vakayagataki na levu ni monoisotopic ni veimataqali yadua. Na vakatautauvatataki ni itukutuku ni metabolite e vakayacori ena kena vakayagataki na pakete ni parokaramu ni komipiuta ni preprocessCore (57).
Vakavakarau ni tiki. Na kalavo a totolo sara na anesthetized ena kaboni daiokisaiti ka decapitated, na uto a totolo sara na kena kau tani mai na ulu, kei na aisi-vakasinaiti na iseleiwau ni vibrating (HM-650 V, Thermo dauqoli vakasaenisi, Walldorf, Jamani) a vakayagataki me musuki kina ki na 300 ki na 375% kasi ni kaboni O5d. CO2) lailai na Ca2 + ACSF (125,0 mm nacl, 2,5 mm kcl, 1,25 mm sodium phosphate tampón, 25,0 mm NaHCo3, 25,0 mm d-suka, 1,0 mm cacl2 kei na 6,0 mm mg302. MOS). Vakadewataka na veitiki ni uto e rawati ki na dua na rumu e tiko kina na Ca2 + ACSF cecere (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-suka, 4.0 mM mM Ca. kei na 310 ki na 320 na mOsm). Maroroya na veitiki ni 20 ki na 30 na miniti me rawa ni vakalesui mai ni bera ni katoni.
katokatoni. E dua na ituvatuva ni maikorosikopu vakarautaki ena dua na rumu ni katokatoni tudei kei na dua na 20x wai ni vakasinaiti ena inaki ni matailoilo (Scientifica) a vakayagataki me baleta na katokatoni kece sara. Na sela ni Purkinje vakasamataki era a vakatakilai ena (i) levu ni yago, (ii) vanua ni yago ni uto, kei na (iii) vakaraitaka na gene ni ripote ni mtYFP ni lumilumisa. Na paipo ni ilavelave kei na dua na veivala ni tip ni 5 ki na 11 na megohms e dreta mai na dua na capillary ni iloilo ni borosilicate (GB150-10, 0.86 mm × 1.5 mm × 100 mm, ivoli vakasaenisi, Hofheim, Jamani) kei na dua na paipo vakadodonu iyaya ni cakacaka (P-1000). Na katokatoni kece e vakayacori ena ELC-03XS npi na iqaqalo ni clamp amplifier (npi vakalivaliva GmbH, Tam, Jamani), ka a lewa na parokaramu ni komipiuta Sikinala (ivakadewa 6.0, vakalivaliva vakalivaliva, vakalivaliva, UK). Na vakatovotovo e volai ena dua na ivakarau ni ivakaraitaki ni 12.5 kHz. Na sikinala e vakasavasavataki ena rua na vakasavasavataki ni Bessel lekaleka-pasi kei na cutoff ni 1.3 kei na 10 kHz vakatautauvata. Na capacitance ni membrane kei na pipette e saumi mai na veiqaravi ni veivakadodonutaki ena kena vakayagataki na amplifier. Na veivakatovolei kece e vakayacori ena ruku ni lewa ni dua na itaba ni Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Jamani), ka a lewa na parokaramu ni komipiuta ni Hokawo (ivakadewa 2.8, Hamamatsu, Jamani).
Na ivakarau ni taucoko-sela ni veivakatorocaketaki kei na vakadidike. Ni bera sara ga ni volai, vakasinaita na pipette ena iwali ni loma e tiko kina na veika oqo: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potasiumi gluconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATPG (Na) kei na 10.0 mM ni bulibuli ni fosfate era a vakadodonutaki ki na pH 7.25, kei na veivakasaurarataki ni osmotic e 290 mOsm (suka). Ni oti ga na kena vakayagataki e dua na kaukauwa ni 0 pA me vakarusa na membrane, na vakacegu ni membrane rawa ni vakarautaki. Na veivala ni vakacuru ilavo e vakarautaki ena kena vakayagataki na hyperpolarized ni -40, -30, -20, kei na -10 pA. Vakarautaka na levu ni isau ni volitika ka vakayagataka na lawa ni Ohm me vakarautaka na veivakacacani ni input. Na itaviqaravi vakataki koya a volai ena dua na clamp ni volitaki me baleta na 5 na miniti, kei na sPSC a vakatakilakilataki ka vakarautaki ena Igor Pro (ivakadewa 32 7.01, WaveMetrics, drano Oswego, Oregon, Amerika) ena kena vakayagataki e dua na ivola ni kilai ni semi-vakataki koya. Na IV curve kei na tudei-matanitu ni gauna oqo e vakarautaki ena kena clamping na batiri ena veimataqali rawa-ka (tekivu mai na -110 mV) ka vakalevutaka na kaukauwa ena 5 mV na ikalawa. Na kena buli na AP a vakatovolei ena kena vakayagataki e dua na depolarizing ni gauna oqo. Clamp na sela ena -70 mV ni vakayagataki tiko e dua na kaukauwa ni gauna oqo. Veisautaka na levu ni ikalawa ni veitiki ni katokatoni yadua vakatikitiki (10 ki na 60 pA). Vakarautaka na levu duadua ni AP ena nomu wilika vakataki iko na spikes ni pulse ka vakavuna na AP cecere duadua. Na AP ni icurucuru e vakadikevi ena kena vakayagataki na ikarua ni vakadewataki ni pulse ni depolarization ka vakavuna taumada e dua se sivia na APs.
Na ituvatuva ni patch perforado kei na vakadidike. Vakayacora na katokatoni ni patch perforated ena kena vakayagataki na ivakarau tudei. Vakayagataka e dua na ATP- kei na GTP-galala pipette ka sega ni tiko kina na veika oqo: 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA kei na 2 mM MgCl2, ka vakadodonutaka ki na pH 7.2 (vakayagataka na KOH). ATP kei na GTP era biu laivi mai na iwali ni intracellular me tarova na sega ni lewai rawa na kena rawa ni curu na membrane ni sela. Na paipo ni ilavelave e vakasinaiti ena dua na amphotericin-e tiko kina na iwali ni loma (rauta ni 200 ki na 250μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) me rawati kina e dua na itukutuku ni ilavelave punched. Amphotericin a vakawabokotaki ena dimethyl sulfoxide (iotioti ni vakasama: 0.1 ki na 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Na vakasama ni DMSO vakayagataki e sega ni dua na kena revurevu bibi ena neurons vulici. Ena gauna ni punching, na veivakacacani ni sala (Ra) e tomani tikoga na kena vakaraitaki, ka sa tekivu na veivakatovolei ni oti na amplitude ni Ra kei na AP vakadeitaki (20-40 na miniti). Na cakacaka vakataki koya e vakarautaki ena dua na volitika kei na/se na clamp ni gauna oqo me baleta na 2 ki na 5 na miniti. Na vakadidike ni itukutuku a vakayacori ena kena vakayagataki na Igor Pro (ivakadewa 7.05.2, WaveMetrics, Amerika), Excel (ivakadewa 2010, kabani ni Microsoft, Redmond, Amerika) kei na GraphPad Prism (ivakadewa 8.1.2, GraphPad parokaramu ni komipiuta Inc., La Jolla, CA). Amerika). Me rawa ni kilai na APs vakataki koya, e vakayagataki na plug-in ni NeuroMatic v3.0c ni IgorPro. Vakatakilakilataka vakataki koya na APs ena kena vakayagataki e dua na icurucuru soli, ka sa veisautaki yadua me baleta na itukutuku yadua. Vakayagataka na gauna ni spike, vakadeitaka na spike vakawasoma kei na kena levu duadua na vakawasoma ni spike totolo kei na ivakarau ni spike vakawasoma.
PN vakatikitikitaki. Ena kena veisautaki ki na ivakarau ni tabaki taumada, PNs a vakasavasavataki mai na cerebellum ni kalavo ena dua na gauna vakatabakidua (58). Me vakalekalekataki, na cerebellum a dissected ka minced ena aisi-batabata dissociation veimaliwai [sega na HBSS Ca2 + kei na Mg2 +, vakaikuritaki ena 20 mM suka, penisilini (50 U / ml) kei na streptomycin (0.05 mg / ml) [ / ml), papain (16 U / ml) y deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg / ml)] Vakayacori me baleta na 30 na miniti ena 30 ° C. Taumada savata na veitiki ni yago ena HBSS veimama e tiko kina na mucus ni yaloka (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) kei na DNase (0.1 mg/ml) ena ivakarau ni katakata ni rumu me tarova na enzymatic digestion, ka qai ena HBSS veimama e tiko kina na 20 mM suka, vakamalumalumutaka ena HBlinm5 (0.05 mg/ml) kei na DNase (0.1 mg/ml) sereka na sela duadua. Na vakacegu ni sela e rawati e a vakasavasavataki ena dua na 70μm na sela strainer, oti era sa qai vakasavasavataki na sela ena veivakasavasavataki (1110 rpm, 5 na miniti, 4°C) ka vakavotukanataki tale ena veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki [HBSS, vakaikuritaki ena 20 mM suka, 20% stremyin bovine ni gone) Serum, (0,05 na mg/milili)]; vakatovotovotaka na bula ni sela kei na iodide ni propidium ka vakadodonutaka na kaukauwa ni sela ki na 1 × 106 ki na 2 × 106 na sela / ml. Ni bera na drodro ni cytometry, na vakacegu e a vakasavasavataki ena dua na 50 μm na sela ni vakasaqa.
Sitomita ni drodro. Na veiwasei ni sela a vakayacori ena 4°C ena kena vakayagataki na misini ni FACSAria III (BD ni veika bula) kei na parokaramu ni komipiuta ni FACSDiva (BD ni veika bula, vakadewa 8.0.1). Na vakacegu ni sela a vakarautaki ena kena vakayagataki e dua na 100 μm na noti ena ruku ni dua na veivakasaurarataki ni 20 psi ena dua na ivakarau ni ~ 2800 na veika e yaco / sekodi. Me vaka ni ivakarau ni gating makawa (levu ni sela, veivakaduiduitaki bimodal, kei na ivakarau ni veivakasavasavataki) e sega ni rawa ni vakadeitaka na dodonu ni veivakaduiduitaki ni PN mai na veimataqali sela tale eso, na iwalewale ni gating e vakarautaki me yavutaki ena veivakatautauvatataki vakadodonu ni kaukauwa ni YFP kei na autofluorescence ena mitoYFP + kei na MitoYFP ni lewa. YFP e vakamarautaki ena kena vakararamataki na ivakaraitaki ena dua na laini ni laser 488 nm, kei na sikinala e laurai ena kena vakayagataki e dua na 530/30 nm ilawalawa ni pasi ni vakasaqa. Ena mitoYFP + kalavo, na kaukauwa ni veiwekani ni Rosa26-mitoYFP dauvolaitukutuku ni gene e vakayagataki talega me vakaduiduitaka na yago ni neuronal kei na tikitiki ni axon. 7-AAD e vakamarautaki ena dua na 561 nm dromodromo laser ka kunei ena dua na 675/20 nm bandpass ni vakasavasavataki me kakua ni okati kina na sela mate. Me rawa ni wasei na astrocytes ena gauna vata ga, na vakacegu ni sela a vakadukadukalitaki ena ACSA-2-APC, sa qai vakararamataki na ivakaraitaki ena dua na laini ni laser 640 nm, kei na dua na 660/20 nm bandpass filter a vakayagataki me kunei kina na sikinala.
Na veitiki ni yago era a vakasoqoni vata era a vakacacani ena veivakacacani (1110 rpm, 5 na miniti, 4°C) ka maroroi ena -80°C me yacova ni sa vakayagataki. Mfn2cKO na kalavo kei na nodra pups ni litter era sa vakalawataki ena siga vata ga me vakalailaitaka na veisau ni iwalewale. Na itukutuku ni FACS kei na vakadidike e vakayacori ena kena vakayagataki na parokaramu ni komipiuta ni FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, Amerika).
Me vaka e sa tukuni oti mai cake (59), na gauna dina ni PCR e vakayagataki me vakatikitikitaki kina na DNA mai na veitiki ni yago vakarautaki me baleta na kena vakarautaki na mtDNA e tarava. Na linearity kei na vakasama ni katubaleka a vakatovolei taumada ena kena cici na qPCR ena duidui na iwiliwili ni sela. Me vakalekalekataki, kumuna na 300 PN ena dua na buffer ni lysis ka oka kina na 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 kei na proteinase K (200 ng/ml) ka vakatubura ena 55 ° C 120 na miniti. Na sela era a vakavotukanataki tale ena 95 ° C me baleta na 10 na miniti me vakadeitaka na taucoko ni inactivation ni proteinase K. Vakayagataka e dua na vakadidike ni TaqMan (Thermo dauqoli) vakatabakidua ki na mt-Nd1, a vakarautaki na mtDNA ena PCR ni veimama-levu ena ivakarau ni PCR ni gauna dina ni 7900HT. Saenisi, naba ni ivola Mm04225274_s1), mt-Nd6 (vakasaenisi ni dauqoli katakata, naba ni dauqoli katakata AIVI3E8) kei na 18S (vakasaenisi ni dauqoli katakata, naba ni ivola Hs99999901_s1) genes.
Vakarautaki ni ivakaraitaki ni proteome. Ena kena vakamamacataki na iwali ena 95 ° C me baleta na 10 na miniti kei na sonicating, ena buffer ni lysis [6 M guanidine koloride, 10 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine waidroka, 10 mM vakalivaliva kei na 100 mM tris- HC pellets ena neuron batabata]. Ena Bioruptor (Diagenode) me baleta na 10 na miniti (30 na sekodi ni uto / 30 na sekodi ni cegu ni gauna). Na ivakaraitaki a vakawaicalataki 1:10 ena 20 mM tris-HCl (pH 8.0), veiwaki vata kei na 300 ng trypsin koula (Promega), ka vakatuburi ena bogi taucoko ena 37°C me rawati kina na taucoko ni digestion. Ena ikarua ni siga, na ivakaraitaki e a vakasavasavataki ena 20,000 g me baleta na 20 na miniti. Na wai e vakawaicalataki ena 0.1% ni asidi ni formic, kei na kena iwali e vakawaicalataki ena StageTips vakataki koya. Na ivakaraitaki a vakamamacataki ena dua na iyaya ni cakacaka ni SpeedVac (Eppendorf vakasama vata kei na 5305) ena 45°C, ka qai vakadaroi na peptide ena 0.1% asidi ni formic. Na ivakaraitaki kece e vakarautaki ena dua ga na gauna mai na tamata vata ga. Me rawa ni vakadikevi na ivakaraitaki ni astrocyte, 4 μg na peptides vakasavasavataki era a vakatakilakilataki ena dua na ivakatakilakila ni tandem (TMT10plex, naba ni ivola 90110, Dauqoli vakasaenisi ni katakata) vata kei na dua na peptide ki na TMT reagent ratio ni 1:20. Me baleta na TMT vakatakilakilataki, 0.8 mg ni TMT vakavotukanataki a vakavoutaki tale ena 70 μl ni ACN sega ni wai, kei na peptide mamaca a vakavoutaki tale ki na 9 μl ni 0.1 M TEAB (bikarbonati ni vakatovotovo), ki na 7 μl ni TMT vakavotukanataki ena ACN a vakacurumi. Na vakasama e 43.75%. Ni oti e 60 na miniti ni vakasucu, na kena isau e a bokoci ena 2 μl ni 5% ni wai. Na peptides vakatakilakilataki era a vakasoqoni vata, vakamamacataki, vakavoutaki tale ena 200 μl ni 0.1% na asidi ni fomu (FA), wasei ki na rua, ka qai vakasavasavataki ena kena vakayagataki na StageTips vakataki koya. Vakayagataka na iotioti ni 3000 cecere ni cakacaka ni wai (iotioti ni 3000 cecere ni cakacaka ni wai), e dua vei rau na veimama e a wasei ena dua na duru ni 1 mm x 150 mm ni rawa-ka vakasinaiti ena 130 Å 1.7 μm C18 na tikitiki (Sega ni wai, catalog150). Vakasaenisi ni dauqoli ni katakata). Veisemati peptides ena dua na drodro ni 30μl/min, veisemati mai na 1% ki na 50% ni veivakabulabulataki B me baleta na 85 na miniti kei na dua na gradient ni kalawa ni 96 na miniti, mai na 50% ki na 95% veivakabulabulataki B me baleta na 3 na miniti, qai 8 na miniti me baleta na 95 % veivakabulabulataki ni B; Na itataqomaki A e 5% ACN kei ​​na 10 mM amoniumi bicarbonate (ABC), kei na itataqomaki B e 80% ACN kei ​​na 10 mM ABC. Soqona na veitikina ena vei 3 na miniti ka cokovata ki na rua na ilawalawa (1 + 17, 2 + 18, kei na so tale) ka vakamamacataka ena dua na misini ni vakasaqa.
LC-MS/MS vakadidike. Me baleta na spectrometry ni levu, na peptides (na naba r119.aq) era a wasei ena dua na duru ni vakadidike ni PicoFrit 25 cm, 75 μm ena loma ni diamita (matailoilo vou ni inaki, na naba ni tiki ni PF7508250) vakaiyaragitaki ena 1.9 μm ReproSil-Pur C12), RAWARAWA-nLC 1200 (Saenisi ni dauqoli ni katakata, Jamani). Na kolomu e maroroi ena 50°C. Na veivakabulabulataki A kei na B e 0.1% na asidi ni fomu ena wai kei na 0.1% na asidi ni fomu ena 80% ACN, vakatautauvata. Era a wasei na peptides mai na 6% ki na 31% na vakasaqa B me baleta na 65 na miniti kei na 31% ki na 50% na vakasaqa B me baleta na 5 na miniti ena dua na gradient ni 200 nl / min. Na peptides vakasavasavataki era a vakadikevi ena dua na ivakarau ni vakasaqaqara ni veivakaduiduitaki (vakasaenisi ni dauqoli ni katakata). Na ivakarau ni m/z ni peptide e vakayacori ena dua na vakatulewa ni 120,000 ena maliwa ni 350 ki na 1500 m/z. Vakayagataka na 27% kaukauwa ni coqa vakatautauvatataki, na kaukauwa duadua ni precursor kei na dua na ituvaki ni sausaumi ni 2 ki na 6 e digitaki me baleta na kaukauwa cecere C veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki (HCD) cleavage. Na gauna ni veisau e vakarautaki ki na 1 s. Na m / z na isau ni tiki ni peptide a vakarautaki ena ion ni veivakarerei ena kena vakayagataki na takete lailai duadua ni AGC ni 5 × 104 kei na gauna ni veivakabulabulataki levu duadua ni 86 ms. Ni oti na veiwasei, na precursor a biu ena lisi ni vakatikitikitaki ni dinamika me baleta na 45 s. TMT-vakatakilakilataki peptides a wasei ena dua na 50 cm, 75 μm vakacaucautaki PepMap duru (vakasaenisi ni dauqoli katakata, naba ni katakata 164942), kei na spectra ni toki era a vakadikevi ena dua na ivakarau ni matailalai ni matailalai ni matailalai (FAIMS) iyaya (Thermo dauqoli vakasaenisi) cakacaka ena rua na volitaki ni veivakadodonutaki ni −50 kei na −70 V. MS3 digitaki yavutaki ena veivakaduavatataki ni veivakaduavatataki e vakayagataki me baleta na ripote ni TMT ion sikinala ni veivakatovolei. Na veibiu ni peptide a vakayacori ena rawarawa-nLC 1200, vakayagataka e dua na 90% elution ni laini ni laini, kei na dua na vakasama ni buffer ni 6% ki na 31%; na veivakabulabulataki A e 0.1% na FA, kei na veivakabulabulataki B e 0.1% na FA kei na 80% na ACN. Na duru ni vakadidike e vakayagataki ena 50°C. Vakayagataka na FreeStyle (ivakadewa 1.6, Thermo dauqoli vakasaenisi) me wasei na faile taumada me vaka na FAIMS veivakadodonutaki vakalivaliva.
Na kena kilai na protein kei na kena levu. Vakayagataka na misini ni vakasaqaqara ni Andromeda vakaduavatataki, na itukutuku taumada a vakadikevi ena kena vakayagataki na MaxQuant vakadewa 1.5.2.8 (https: maxquant.org/). Me ikuri ni Cre recombinase kei na YFP veitarataravi e rawati mai na Aequorea qaqa, a vakasaqarai na spectra ni tikitiki ni peptide me baleta na veitarataravi ni canonical kei na veitarataravi ni isoform ni proteome ni ivakamacala ni mouse (ID ni Proteome UP000000589, lavetaki mai na UniProt ena Me2010). Na vakasavasavataki ni methionine kei na protein N-ivakataotioti ni vakasavasavataki era a vakaturi me vaka na veisau veisautaki; a vakarautaki me vaka na veisau tudei. Na ivakarau ni vakasaqa e vakarautaki ki na “vakatabakidua” kei na “trypsin/P”. Na iwiliwili lailai duadua ni peptides kei na peptides ni kaukauwa e vakayagataki me baleta na kena kilai na protein e 1; na iwiliwili lailai duadua ni peptides duatani e 0. Ena ruku ni ituvaki ni veiganiti ni mape ni peptide, na iwiliwili ni kena kilai na protein e 0.01. Na “iKarua ni Peptide” digidigi e vakatarai. Vakayagataka na “veiganiti ena maliwa ni cici” digidigi me toso kina na veivakatakilai rawaka ena maliwa ni faile taumada duidui. Vakayagataka na LFQ lailai duadua na wiliwili ni iwiliwili 1 me baleta na ivakatakilakila-galala ni vakatautauvatataki (LFQ) (60). Na kaukauwa ni LFQ e vakasavasavataki me baleta e lailai duadua e rua na ivakatagedegede dodonu ena lailai duadua e dua na ilawalawa ni genotype ena veigauna yadua, ka sa extrapolated mai na dua na veiwaseyaki ni ivakarau kei na dua na rabailevu ni. 0.3 ka toso sobu ki na 1.8. Vakayagataka na ituvatuva ni kompiuta ni Perseus () kei na R (r-cakacaka.org/) me dikevi kina na veika e rawati ena LFQ. E dua na sala rua na ivakarau ni t vakatovotovo mai na limma parokaramu ni komipiuta ni pakete a vakayagataki me baleta na vakadidike ni vakamacala duidui (61). Na vakadidike ni itukutuku ni vakadidike e vakayacori ena kena vakayagataki na ggplot, dina, dina, GGally kei na pheatmap. Na itukutuku ni veivakabulabulataki yavutaki ena TMT a vakadikevi ena kena vakayagataki na ivakarau ni MaxQuant 1.6.10.43. Vakasaqara na itukutuku ni proteomics kaukauwa mai na itukutuku ni proteomics ni tamata ni UniProt, ka a lavetaki ena Sepiteba 2018. Na vakadidike e oka kina na isotope savasava ni veivakadodonutaki ni ka e vakarautaka na dauteitei. Vakayagataka na limma ena R me baleta na vakadidike ni vakamacala duidui. Na itukutuku taumada, itukutuku ni vakasaqaqara ni itukutuku, kei na itukutuku ni vakadidike ni cakacaka kei na kena isau era maroroi kece ena ProteomeXchange veiwekani ena PRIDE itokani ni maroroi kei na itukutuku ni seti ni ivakatakilakila PXD019690.
Na ivakamacala ni cakacaka e vakavutuniyautaka na vakadidike. Na iyaya ni cakacaka ni vakadidike ni sala ni vuku (QIAGEN) a vakayagataki me vakadeitaka na vutuniyau ni vosa ni vakamacala ni cakacaka ni itukutuku e vakarautaki ena 8 na macawa (iTaba 1). Me vakalekalekataki, na lisi ni protein vakailavo e rawati mai na LC-MS / MS (tandem levu spectrometry) vakadidike ni itukutuku e vakayagataki vata kei na ivakatagedegede ni filter oqo: Mus musculus e digitaki me vaka na mataqali kei na itukutuku, kei na iwasewase e vakaraitaka na P yaga veisautaki mai vei Benjamini me baleta na vakavutuniyautaki 0.05 se lailai e vakasamataki me bibi. Me baleta na kalavo oqo, na lima na iwasewase ni sivia e cake ena veisoqosoqo yadua e yavutaki ena veisautaki ni P na isau e vakaraitaki. Vakayagataka e vuqa na t-vakatovolei, vakayagataka na parokaramu ni boost ni laini ni rua na ivakatagedegede ni Penijamini, Krieger, kei Yekutieli (Q = 5%), na vakadidike ni vakaraitaki ni protein ni gauna ni vuli e vakayacori ena veidigitaki bibi e laurai ena veimataqali yadua, kei na laini yadua e vakadikevi vakatikitiki. E sega ni gadrevi me ciqomi e dua na SD tudei.
Me rawa ni vakatautauvatataki na veika e rawati mai na vakadidike oqo kei na itukutuku tabaki ka vakatubura e dua na iyaloyalo ni Venn ena itaba 1, keitou a cokovata na lisi ni protein vakailavo kei na MitoCarta 2.0 ivakamacala (24). Vakayagataka na iyaya ni cakacaka ena initaneti Droinitaka na iyaloyalo ni Venn (http.
Me baleta na itukutuku matailalai ni iwalewale ni iwiliwili e vakayagataki me baleta na vakadidike ni proteomics, yalovinaka raica na iwasewase veiganiti ni iyaya kei na iwalewale. Me baleta na veivakatovolei kece tale eso, na itukutuku matailalai e rawa ni kunei ena italanoa veiganiti. Vakavo ga ke vakaraitaki vakatani, na itukutuku kece e vakaraitaki me vaka na kena ibalebale ± SEM, kei na vakadidike kece ni iwiliwili e vakayacori ena kena vakayagataki na parokaramu ni komipiuta ni GraphPad Prism 8.1.2.
Me baleta na ikuri ni iyaya me baleta na itukutuku oqo, yalovinaka raica na http.
Oqo e dua na itukutuku ni rawa-ka e dolavi ka veisoliyaki ena ruku ni veivakadonui ni Creative Commons Attribution-Sega ni Veivoli Laiseni, ka vakatara na kena vakayagataki, veisoliyaki kei na kena vakadewataki ena dua na sala, me vaka ga ni iotioti ni kena vakayagataki e sega ni baleta na rawa-ka vakabisinisi kei na premise sa ikoya na cakacaka taumada e dodonu. Ivakatakilakila.
iVakamacala: Keitou kerei iko ga mo vakarautaka na nomu itikotiko ni imeli me rawa kina vua na tamata o vakatura ki na tabana e kila ni o vinakata me ra raica na imeli ka sega ni spam. Eda na sega ni taura e dua na itikotiko ni imeli.
Na taro oqo e vakayagataki me vakatovolei kina se o iko e dua na dausiko vanua ka tarova na vakau ni spam vakataki koya.
Mai vei E. Motori, I. Atanasov, SMV Kochani, K. Folz-Donahue, V. Larisoni
Na vakadidike ni proteomics ni veitiki ni yago e sega ni cakacaka e vakaraitaka ni sa vakayagataki na parokaramu ni metabolic me vorata na vakacacani ni yago.
Mai vei E. Motori, I. Atanasov, SMV Kochani, K. Folz-Donahue, V. Larisoni
Na vakadidike ni proteomics ni veitiki ni yago e sega ni cakacaka e vakaraitaka ni sa vakayagataki na parokaramu ni metabolic me vorata na vakacacani ni yago.
©2020 iSoqosoqo ni Amerika me baleta na Toso ki liu ni Saenisi. dodonu kece e maroroi. AAAS es un partner de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef y COUNTER. Na toso ki liu ni saenisi 2375-2548.