Na veiwasei ni protein ena sala ni veivakabulabulataki e bibi me maroroi kina na veiwasei ni sela kei na homeostasis. Me ikuri ni veivakaduiduitaki ni shell-veimaliwai, na itavi ni lipids ena veivakaduiduitaki ni kinesin ena iwalewale ni veivakau secretory e dua na taro yavutaki balavu ka se bera ni saumi. Eke, eda vakayacora na 3D ena dua ga na gauna ni roka cecere-vakatulewa ni gauna dina ni iyaloyalo me vakadinadinataka ena vivo ni vou na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki kei na veivakabulabulataki balavu sara ni veivakabulabulataki era sa vakasoqoni vata ka vakawasei ki na veivakaduiduitaki vakatabakidua ni veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki mai na veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki mai na veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki. Me kena ikuri, eda vakaraitaka ni balavu ni sinucodo ni ceramide ena endoplasmic ni veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki e bibi sara me baleta na veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki oqo. Na noda vuli e vakarautaka na imatai ni vakadodonu ena ivakadinadina ni vivo me vakalawataki kina na protein ni ka e yavutaki ena balavu ni lipid ni sinucodo ki na vanua ni vakau digitaki ena sala ni secretory.
Ena sela ni eukaryotic, na protein e vakarautaki ena reticulum ni endoplasmic (ER) e qai vakarautaki ena gauna ni veivakau ena sala ni veivakabulabulataki me baleta na kena vakau ki na nodra vanua veiganiti ni sela (1). Me ikuri ni veivakaduiduitaki ni kote-veimaliwai, e a vakasamataki vakabalavu ni so na lipids e rawa ni veiqaravi talega me vaka na vanua ni biubiu digitaki ena kena vakasoqoni vata ki na veivanua ni membrane vakatabakidua ni protein vakatabakidua (2-5). Ia, e se lailai tikoga na ivakadinadina vakadodonu ena vivo me vakadinadinataka na iwalewale oqo e rawa ni lipid-yavutaki. Me rawa ni wali na leqa taumada oqo, keitou vulica ena leveni na sala e duidui kina na kena vakau yani mai na ER. GPI-APs e dua na mataqali lipid-semati na sela ni dela ni sela ( 6, 7). Na GPI-AP e dua na protein vakatikitiki e vakacurumi ki na veitiki ni plasma e tautuba ena iwasewase ni glycolipid (ikeli ni GPI). Era ciqoma na GPI na isema me vaka na veisau ni vakadewa ni oti na vakadewa ena lumen ni ER (8). Ni oti na kena vakacurumi, GPI-AP e lako sivita na iyaya ni Golgi (5, 9) mai na ER ki na ivakarau ni plasma. Na tiko ni GPI na isema e vakavuna na GPI-AP me vakau vakatikitiki mai na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki (oka kina na veivakabulabulataki tale eso ni plasma) ena sala ni veivakabulabulataki (5, 9, 10). Ena sela ni leveni, GPI-APs era tawasei mai na so tale na protein vunitaki ena reticulum ni endoplasmic, ka qai vakacurumi ki na vesicles duatani e vakaruguti ena kote ni protein vereverea II (COPII) (6, 7). Na veivakadeitaki ni iwalewale ni veiwasei oqo ena iwalewale ni vakau ER e sega ni matata, ia e vakasamataki ni iwalewale oqo ena gadrevi kina na lipids, vakabibi na kena vakavoutaki na ituvatuva ni iwase ni lipid ni GPI na isema (5, 8). Ena leveni, GPI lipid vakavoutaki e tekivu sara ga ni oti na GPI vakacurumi, kei na vuqa na gauna, e vakavuna na ceramide me vesuki ki na 26-kaboni balavu-senikau vakasinaiti na asidi ni uro (C26: 0) (11, 12). C26 seramidi na seramidi levu duadua e bulia na sela ni leveni me yacova mai oqo. E vakarautaki ena ER ka levu vei ira e vakau yani ki na iyaya ni Golgi ena veisele ni COPII (13). Na ER vakau ni GPI-AP vakatabakidua e gadrevi kina na tomani tikoga ni ceramide ni veivakaduiduitaki (14, 15), kei na kena veibasai, na saumaki mai ni veivakaduiduitaki ki na inositol ni veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki (IPC) ena iyaya ni Golgi e vakatau ena veivakaduiduitaki ni iyaya ni GPI (16). Na vakadidike ni bula kei na veitiki ni yago e vakaraitaka ni balavu sara na ceramides ni acyl ni sinucodo e rawa ni cokovata me buli kina na vanua vakarautaki kei na iyau vakayago duatani (17, 18). Na itukutuku oqo e kauta mai na vakasama ni C26 ceramide kei na GPI-AP vata kei na C26 ceramide vakayagataka na nodra iyau vakayago me ra coalesce ki na veivanua vakarautaki se vanua ena vanua ni lipid ni membrane ni ER vakatautauvatataki. E vakalevutaki kina na kaukauwa lekaleka kei na sega ni vakasinaiti (C16: 1 kei na C18: 1) (19, 20). Na veivanua oqo ena digitaki vakatabakidua ena vanua ni biubiu ni ER vakatabakidua (ERES), na vanua e rawa ni co-vakau kina na GPI-AP yavutaki ena ceramide kei na ceramide ki na Golgi ena vesicle vata ga ni COPII vakatabui (5).
Ena vuli oqo, eda sa vakatovolei vakadodonu na iwalewale oqo yavutaki ena lipid ena kena vakayagataki na super-vakatulewa confocal dina-gauna ni iyaloyalo ni iyaloyalo (SCLIM), ka sa dua na iwalewale ni iyaloyalo ni iyaloyalo ka rawa ni raica ena dua ga na gauna na proteins vakatakilakilataki fluorescently Na tolu na roka kei na tolu na sela cecere extremely kei na iyaloyalo (3D) (21, 22).
Keitou a vakayagataka taumada na tekinolaji ni SCLIM me vakamacalataka tale na sala e dau vakatovotovotaki kina na GPI-AP vata kei na ilawalawa ni C26 ceramide mai na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni oti na biuta na ER ena S. Me rawa ni dikevi na veiwasei ni ER, keitou vakayagataka e dua na ivakarau ni gene ka rawa ni raica vakadodonu na iyaya vou ni veivakatorocaketaki e curu ki na ERES ena vivo (7, 23). Me vaka na icolacola, keitou digitaka na C26 ceramide-yavutaki GPI-AP kasi1 vakatakilakilataki ena drokadroka ni drokadroka ni drokadroka (GFP) kei na drokadroka ni drokadroka ni drokadroka Mid2 vakatakilakilataki ena drokadroka ni drokadroka ni drokadroka (iRFP), ruarua oqo e taketetaka na drokadroka ni drokadroka ni drokadroka (24-26). Ena sec31-1 na ivakarau ni katakata-vakasama, na rua na ka oqo e vakaraitaki ena ruku ni dua na dauvakatorocaketaki ni galactose-vakavuna kei na dua na ivakatakilakila ni ERES vakayavutaki. Ena katakata vakaitamera (37°C), baleta na sec31-1 veisau e vakaleqa na cakacaka ni COPII kote iwasewase Sec31 me tarova na COPII tubu kei na ER vakau, vou na iyaya ni vakasoqoni vata e kumuni ena ER (23). Ni oti na kena vakamamacataki ki na dua na ivakarau ni katakata lailai (24°C), na sec31-1 mutant na sela vakabulai mai na vanua ni veivakabulabulataki, kei na kumuni vou ni iyaya ni veivakabulabulataki sa tekivu me vakau tani mai na ER. Na vakaraitaki ni CLIM e vakaraitaka ni levu vei ira na kasi vou kei na Mid2-iRFP era se kumuni tikoga ena ER ni sec31-1 na sela ni mutant ni oti na kena vakasucumi ena 37°C ka qai sereki ena 24°C me baleta na 5 na miniti (itaba 1). Me vaka ni sa veisoliyaki na Mid2-iRFP ena ER taucoko ni ER, kei na Gas1-GFP e vakatabakidua ka soqoni vata ena vanua ni ER sega ni tomani rawa, na nodra veisoliyaki e duidui sara (itaba 1, A ki na C kei na iyaloyalo S1). Me kena ikuri, me vaka e vakaraitaki ena itaba 1D, na ilawalawa ni Gas1-GFP e sega ni tiko kina na Mid2-iRFP. Na veika oqo e vakaraitaka ni GPI-AP kei na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki era a wasei ki na veivanua duidui ni veivakabulabulataki ni ER ena gauna taumada. Na ilawalawa ni Gas1-GFP e veivolekati kei na dua na ERES vakatabakidua e vakatakilakilataki ena mCherry ni COPII kote ni protein Sec13 (itaba 1, E kei na F, kei na iyaloyalo S1) (23).
sec31-1 na sela vakaraitaka na galactose-vakavuna na veivakaduiduitaki, e dua na sinucodo balavu ni acyl (C26) ceramide GPI-AP gas1-GFP (GPI-AP, drokadroka) kei na protein ni transmembrane Mid2-iRFP (TMP, karakarawa) kei na oqo na ERES tara cake vakatakilakilataki Sec13-mCherry ena miniti, toso ki na 24°C, ka vakaraitaki ena SCLIM 5 na miniti e muri. (A ki na C) e vakaraitaka e dua na mata cokovata se dua ga na iyaloyalo 2D ni dua na waqavuka (A), e dua na iyaloyalo ni 2D ni vakaraitaki ni 10 z-wase (B) se e dua na iyaloyalo ni hemisphere ni sela 3D ni iyaya kei na ivakatakilakila ni ERES (C). Barra de escala 1μm (A y B). Na iuniti ni ivakarau e 0.551μm (C). Gas1-GFP a laurai ena veivanua se ilawalawa ni ER vakatikitiki, ni Mid2-iRFP a laurai ka veisoliyaki ena loma taucoko ni ER (C). (D) Na kalavo e vakaraitaka na kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa (imawi). AU, iunite ni veivakaduiduitaki. (E kei na F) e vakaraitaka na iyaloyalo 3D ka cokovata na iyaya kei na ivakatakilakila ni ERES. Na ilawalawa ni kasi1-GFP era a kunei volekata na ERES vakatabakidua. Na iuniti ni ivakarau e 0.551μm. (F) Na vulavula kaukauwa ni gasau e vakatakilakilataka na ilawalawa ni Gas1-GFP e salavata kei na ERES. Na lomadonu kei na imatau ni ilawalawa e vakaraitaka na iyaloyalo ni 3D vakalevutaki ni merged kei na dua na rai veisautaki ni ilawalawa digitaki ni Gas1-GFP.
Na veiwekani voleka ni vanua ena maliwa ni ilawalawa ni Gas1-GFP kei na dua na ERES vakatabakidua e vakaraitaka ni rawa ni curu na Gas1-GFP ki na ERES digitaki, ka sa duidui mai na digidigi e vakayagataka na Mid2-iRFP me biuta na ER. Me wali na kena rawa oqo, keitou vakarautaka na ERES ratio me baleta ga e dua se rua na iyaya (iTaba 2, A ki na C). Keitou kunea ni levu na ERES (70%) e tiko kina e dua na mataqali iyaya. Na iyaloyalo e ra ni itaba 2C e vakaraitaka e rua na ivakaraitaki matailalai ni ERES kei na Gas1-GFP duadua ga (itaba 1) se Mid2-iRFP duadua ga (itaba 2). Ena kena veibasai, rauta ni 20% ni ERES e tiko kina e rua na ka e veicoqacoqa ena dua ga na vanua. E kunei ni so na ERES (10%) e tiko kina e rua na mataqali iyaya, ia era sa tu vakatikitiki ena vanua e matata ni duidui. O koya gona, na vakadidike ni iwiliwili oqo e vakaraitaka ni oti na ER e vakau yani, GPI-AP kasi1-GFP kei na transmembrane ni colacola Mid2-iRFP era wasei ki na duidui ERES (itaba 2D). Na cakacaka ni veiwasei oqo e salavata sara ga kei na vakadidike ni bula sa oti (6) kei na vakatulewa ni morphological (7). Eda rawa talega ni raica na itovo ni iyaya vakatikitiki e curu ki na ERES (iTaba 2E kei na iyaloyalo S2). Na itaba 2E e vakaraitaka ni dua ga na iwase lailai ni Gas1-GFP (ilawalawa 3) se Mid2-iRFP (ilawalawa 4) e curu ki na ERES mai na dua na yasana ka sa vakatikitikitaki ena dua na vanua vakatikitiki. Na ilawalawa 5 ni itaba 2E e vakaraitaka ni Gas1-GFP kei na Mid2-iRFP era dau kune ena so na gauna ena ERES vata ga, ia era curu mai na veiyasana duidui ka ra vakanamata ena veivanua duidui ka rawa ni matataka na veimataqali vesicles ni COPII. Keitou vakadeitaka talega ni raica na veibiu kei na veiwasei ni C26 ceramide-yavutaki GPI-AP kasi1 me vaka na ERES digitaki e vakatabakidua baleta ni dua tale na icolacola ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki, na GFP-vakatakilakilataki na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki Axl2 (27 ), vakaraitaka na itovo tautauvata ki na Mid2-iRFP. (Iyaloyalo S1 kei na iyaloyalo S3). Na Axl2-GFP vou e veisoliyaki ena ER ni ER me vaka na Mid2-iRFP (iTaba S1, A kei na B), ka sa co-vakaitikotiko vata kei na Mid2-iRFP ena levu na ERES (iTaba S1, B ki na D). Na ilawalawa 1 kei na 2 ni itaba 1. S1C e vakaraitaka e rua na ivakaraitaki matailalai ni ERES na vanua e rua na icolacola ni transmembrane e veicurumaki. Ena ituvaki oqo, ruarua na iyaya e curu vata ki na ERES (iTaba S1E, ilawalawa 3 kei na iyaloyalo S3).
Na sec31-1 sela vakaraitaka na galactose inducible secretions, Gas1-GFP (GPI-AP, drokadroka) kei na Mid2-iRFP (TMP, karakarawa) kei na veivakadeitaki ni ERES vakatakilakilataki Sec13-mCherry (ERES, magenta) era a biu ena 37 Ni oti na kena vakatuburi me baleta na °C ki na 30 na miniti. buloko, kei na iyaloyalo kei na SCLIM ni oti e 20 na miniti. (A ki na C) Mata 2D iyaloyalo ni vakaraitaki (A; ivakarau ni barausa, 1μm) se 3D na iyaloyalo ni hemisphere ni sela (B kei na C; iuniti ni ivakarau, 0.456μm) ni iyaya kei na 10 z-wase vakatakilakilataki ena ERES. Na ilawalawa e ra ena (B) kei na ilawalawa ena (C) vakaraitaka na iyaloyalo vakarautaki me vakaraitaka ga na iyaya e tiko ena ERES (vulavula) [Kasi1-GFP (vulavula) kei na Mid2-iRFP (vulavula rarama)]. (C) Dolava na gasau: ERES e kauta ga e dua na tiki ni iyaya (1 ki na 4). Na matanivola vulavula: ERES e tiko kina na iyaya vakatikitiki (5). Na dakaititi vulavula kaukauwa: ERES e tiko kina na co-tiko na icolacola. Ena ruku: Na ERES duadua digitaki e tiko kina ga na kasi1-GFP (1) se Mid2-iRFP (2). Barra de escala, 100 nm. (D) Na vakalevutaki ni itaba lailai e vakamacalataki ena (C). Na ivakatautauvata ni pasede ni ERES e tiko kina e dua ga na icolacola (Kasi1-GFP se Mid2-iRFP), icolacola vakatikitiki kei na icolacola veicurumaki. Ena tolu na veivakatovolei tudei, n = 432 ena 54 na sela. Bara ni cala = SD. Rua na iqaqalo sega ni veiwatini t vakatovotovo. *** P = 0,0002. (E) 3D iyaloyalo ni ERES digitaki ni iyaya vakatikitikitaki vakatakilakilataki ena (C). Gas1-GFP (drokadroka) (3) se Mid2-iRFP (karakarawa) (4) e curu ki na ERES (vulavula) mai na dua na yasana ka vakatabui ki na dua na vanua lailai ena loma ni ERES. Ena so na gauna, na mataqali iyaya ruarua e curu ki na ERES vata ga (5) mai na yasana vata ga ka ra vakatikitikitaki ena dua na vanua tu vakatikitiki ena loma ni ERES. Barra de escala, 100 nm.
Tarava, keitou vakatovolea e dua na vakasama ni ceramide ni acyl balavu ni sinucodo (C26) e tiko ena ER ni draiva na veisoqoni vakatabakidua kei na veiwasei ni Gas1 ki na ERES digitaki. Me rawa ni oqo, keitou vakayagataka e dua na veisautaki ni leveni GhLag1, ena kena sa sosomitaki na rua na ceramide ni ceramide ni Lag1 kei na Lac1 mai na GhLag1 (na homolog ni Lag1 ni vutinisipi), ka vakavuna e dua na leveni kei na dua na leveni ni sela ni leveni lekaleka cake mai na mataqali veikau (irairai 3A) (2). Na vakadidike ni kaukauwa ni kaukauwa (MS) e vakaraitaka ni ena veimataqali manumanu kila, 95% ni iwiliwili taucoko ni kaukauwa e balavu sara (C26) kaukauwa ni kaukauwa, ia ena GhLag1, 85% ni kaukauwa e balavu sara (C18 kei na C16). ), 2% ga ni seramidi e balavu sara (C26) seramidi ni sinucodo. E dina ga ni C18 kei na C16 na ceramides na ceramides levu e kunei ena GhLag1 na membrane me yacova mai oqo, MS vakadidike e vakadeitaka talega ni GPI na isema ni kasi1-GFP vakaraitaki ena mataqali GhLag1 e tiko kina na C26 ceramides, ka sa vakatauvatani ki na lipids ni mataqali manumanu kila. Na kena ivakarau e tautauvata (iTaba 3A) (26). O koya gona, e kena ibalebale oqo ni ceramide vakavoutaki enzyme Cwh43 e digitaki sara vakalevu me baleta na C26 ceramide, me vaka e vakaraitaki ena itaba 26, e vinaka cake me vakacurumi na ikeli ni GPI mai na dua na ilavo lailai ni C26 ceramide ena GhLag1 na mataqali. S2 (29). Ia, na sela ni GhLag1 vakatabakidua ga e tiko kina na C18-C16 na ceramide, ni Gas1-GFP e se tiko ga kina na C26 na ceramide. Na dina oqo e cakava na mataqali oqo e dua na iyaya ni cakacaka vinaka duadua me wali kina vakatabakidua na leqa ni balavu ni sinucodo ni acyl ni ceramide ni membrane ena ER. Na itavi vakasama ni kalasi kei na veiwasei. Oti, keitou a vulica taumada na rawa ni C26 kasi1-GFP me vakasoqoni vata ena ilawalawa ena GhLag1 vata kei na dua na allele ni mutant ni katakata-vakasama ni sec31-1 ena kena vakayagataki na ivakarau ni vakadidike ni kaukauwa, na vanua ga e tiko kina na balavu (C18-C16) na sinucodo ena ER ni kaukauwa ni ceramide (iVakaraitaki 3). Keitou raica ni ena sec31-1, e levu na kasi 1-GFP a vakatabakidua ena ilawalawa, ni kasi 1-GFP ena sec31-1 GhLag1 kei na balavu (C18-C16) balavu ceramide ER na isema e vakabibi sega ni vakailawalawa ka veisoliyaki ena Ena taucoko ni ER na isema. Me vakadodonutaki, baleta ni C26 ceramide-yavutaki na ilawalawa e veivolekati sara kei na ERES vakatabakidua (iTaba 1), keitou sa qai vakadikeva se na iwalewale oqo e rawa ni okati talega kina na cakacaka ni ER vakauta na protein ni iwalewale. GPI-AP vakayagataka e dua na ivakarau ni COPII vakatabakidua me baleta na ER vakau, ka sa vakalawataki vakalevu ena Ted1′s vakavoutaki ni ituvatuva ni iwase ni glycan ni iyaya ni GPI (30, 31). Na recombinant GPI-glycan sa qai kilai mai na transmembrane na icolacola ni ciqomi p24 vereverea, ka sa qai digitaka na Lst1, ka sa ikoya e dua na isoform vakatabakidua ni iwasewase levu ni icolacola ni vesuki ni icolacola Sec24, ka bulia e dua na GPI-AP-vutuniyau COPII Vesicles e gadrevi (31). O koya gona, keitou a tara e dua na mutant vakarua ka cokovata na kena bokoci na veitiki ni dua ga oqo (na p24 vereverea ni iwasewase Emp24, GPI-glycan vakavoutaki ni enzyme Ted1 kei na Lst1 vakatabakidua ni COPII) kei na sec31-1 mutant na mataqali, ka vulici ira E rawa beka me buli na GFP1-c3). Eda raica ni ena sec31-1emp24Δ kei na sec31-1ted1Δ, na kasi 1-GFP e vakalevu sara na unclustered ka veisoliyaki ena loma taucoko ni ER membrane, me vaka e laurai taumada ena sec31-1 GhLag1, ni ena sec31-1lst1Δ, na kasi 1-G1 Me vaka na sec3. Na veika oqo e vakaraitaka ni ikuri ni kena tiko na C26 ceramide ena ER ni ER, na ilawalawa ni Gas1-GFP e gadrevi talega me vauci ki na p24 ni veivakacacani, ka sega ni gadrevi kina na veivakacakacakataki vakatabakidua ni Lst1. Oti, keitou vakadikeva na kena rawa ni vakalawataki na balavu ni sinucodo ni ceramide ena ER ni ER na kena vauci na Gas1-GFP ki na p24. Ia, keitou kunea ni tiko na C18-C16 ceramide ena membrane e sega ni vakaleqa na GPI-glycans vakavoutaki mai na p24 vereverea (iTaba S3 kei na S4, A kei na B) se vesuki ki na GPI-AP kei na vakau GPI-AP. rawa. Vakacakacakataki COPII mataqali lailai Lst1 (iTaba S4C). O koya gona, C26 ceramide-vakararavi na ilawalawa e sega ni gadrevi kina na veimaliwai ni protein kei na duidui ni ER vakauta na iwalewale ni protein, ia e tokona e dua na iwalewale ni veivakaduiduitaki tale eso e vakauqeti mai na balavu ni lipid. Oti, keitou vakadikeva se na balavu ni sinucodo ni acyl ni ceramide ena ER ni ER e bibi me baleta na kena vakawasomataki vakavinaka na Gas1-GFP me vaka na ERES digitaki. Me vaka ni Gas1 ena GhLag1 na mataqali vata kei na lekaleka-senikau ceramide biuta na ER ka curu ki na plasma ni membrane (iTaba S5), keitou vakabauta ni kevaka e vakauqeti na veiwasei ena balavu ni ceramide acyl senikau, na Kasi1 ena GhLag1 mataqali e rawa ni vakadodonutaki tale ka kosova. ERES iyaya kei na membrane vata ga.
(A) Na sela ni GhLag1 vakabibi e tiko kina na C18-C16 ceramides lekaleka, ni GPI na isema ni kasi1-GFP e se tiko ga na C26 IPC vata ga me vaka na sela ni mataqali manumanu kila. E cake: acyl sinucodo balavu ni vakadidike ni ceramide ena sela ni sela ni manumanu-mataqali (Wt) kei na GhLag1p veimataqali ena veimataqali vakaitamera (MS). Na itukutuku e vakaraitaka na pasede ni ceramide taucoko. Na ivakatautauvata ni tolu na veivakatovolei tudei. Bara ni cala = SD. Rua na iqaqalo sega ni veiwatini t vakatovotovo. **** P <0,0001. Na ilawalawa e ra: MS vakadidike ni acyl na balavu ni sinucodo ni IPC e tiko ena Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI na isema vakaraitaki ena manumanu kila-mataqali kei na GhLag1p na veimataqali. Na itukutuku e vakaraitaka na pasede ni sikinala taucoko ni IPC. Na ivakatautauvata ni lima na veivakatovolei tudei. Bara ni cala = SD. Rua na iqaqalo sega ni veiwatini t vakatovotovo. ns, sega ni bibi. P = 0,9134. (B) Na iyaloyalo lailai ni fluorescence ni sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ kei na sec31-1lst1Δ na sela e vakaraitaka na galactose-vakauqeti na kasi 1-GFP era a vakasucumi ena 37 ° C me baleta na sala ni 30 ° C me baleta na 37 ° C me baleta na 30°C me baleta na 30°C. ni oti na 24°C. Kaukauwa vulavula: ER kasi1-GFP ilawalawa. Dolava na gasau: E sega ni vakasoqoni vata na Gas1-GFP e veisoliyaki ena membrane taucoko ni ER, ka vakaraitaka na ER itovo ni mama ni niukilia ni veivakacacani. Barra de escala, 5μm. (C) Na vakalevutaki ni itaba lailai e vakamacalataki ena (B). Na ivakatautauvata ni pasede ni sela kei na ituvatuva ni Gas1-GFP. Ena tolu na veivakatovolei tudei, n≥300 na sela. Bara ni cala = SD. Rua na iqaqalo sega ni veiwatini t vakatovotovo. **** P <0,0001.
Me wali vakadodonu na leqa oqo, keitou vakayacora na SCLIM vakaraitaki ni kasi 1-GFP kei na Mid2-iRFP ena GhLag1 vata kei na sec31-1 na ivakarau ni katakata-vakasama ni veisau (itaba 4 kei na iyaloyalo S4). Ni oti na ER a maroroi ena 37°C ka qai vakagalalataki ena 24°C, e levu na Gas1-GFP vou e sega ni vakasoqoni vata ka veisoliyaki ena loma taucoko ni ER membrane, me vaka e laurai ena veivakasarasarataki vakaitaukei (iTaba 4, A kei na B ). Me kena ikuri, e dua na pasede levu ni ERES (67%) e oka kina e rua na mataqali iyaya co-tiko kina (iTaba 4D). Na ilawalawa 1 kei na 2 ni itaba 4C e vakaraitaka e rua na ivakaraitaki matailalai ni ERES kei na veivakacacani ni kasi1-GFP kei na Mid2-GFP. Me kena ikuri, na iyaya ruarua era a vakacakacakataki ki na ERES vata ga (iTaba 4E, ilawalawa 3 kei na iyaloyalo S4). O koya gona, na noda rawata e vakaraitaka ni balavu ni ceramide acyl na sinucodo ena ER na membrane e dua na ka bibi ni vakatulewa ni ER na protein ni vakasoqoni vata kei na veiwasei.
Sec31-1 GhLag1 sela vakaraitaka na galactose-vakavuna na veivakaduiduitaki, kasi 1-GFP (GPI-AP, drokadroka) kei na Mid2-iRFP (TMP, karakarawa) kei na ERES-vakatakilakilataki Sec13-mCherry (ERES, magenta) Vakatuburi ena 37 ° C. Tomana tiko me baleta na 30 na miniti, lutu ki na 24°C me sereka na veivakacacani, kei na iyaloyalo vata kei na SCLIM ni oti e 20 na miniti. (A ki na C) Mata 2D iyaloyalo ni vakaraitaki (A; ivakarau ni barausa, 1μm) se 3D na iyaloyalo ni hemisphere ni sela (B kei na C; iuniti ni ivakarau, 0.45μm) ni 10 z-wase vakatakilakilataki ena iyaya kei na ERES. Na ilawalawa e ra ena (B) kei na ilawalawa ena (C) vakaraitaka na iyaloyalo vakarautaki me vakaraitaka ga na iyaya e tiko ena ERES (vulavula) [Kasi1-GFP (vulavula) kei na Mid2-iRFP (vulavula rarama)]. (C) Na dakaititi vulavula vakasinaiti: ERES, iyaya e veicurumaki. Dolava na matanivola: E dua ga na ka e tiko ena ERES. Na ilawalawa e ra: Na ERES digitaki e tiko kina na iyaya e veicurumaki (1 kei na 2) vakatakilakilataki ena (C). Barra de escala, 100 nm. (D) Na vakalevutaki ni itaba lailai e vakamacalataki ena (C). Ena sec31-1 kei na sec31-1 GhLag1 iuniti, e dua ga na icolacola (Kasi1-GFP se Mid2-iRFP) e okati kina, kei na ivakatautauvata ni pasede ni ERES me baleta na icolacola tu vakatikitiki kei na icolacola veicurumaki. Ena tolu na vakatovotovo tudei, n = 432 ena 54 na sela (sec31-1) kei na n = 430 ena 47 na sela (sec31-1 GhLag1). Bara ni cala = SD. Rua na iqaqalo sega ni veiwatini t vakatovotovo. *** P = 0,0002 (tikina 31-1) kei na ** p = 0,0031 (tikina 31-1). (E) 3D iyaloyalo ni ERES digitaki kei na veivakacacani ni iyaya (3) vakatakilakilataki ena (C). Gas1-GFP (drokadroka) kei na Mid2-iRFP (karakarawa) volekata na ERES (dromodromo) mai na yasana vata ga ka tiko ena vanua vakatabui ni ERES vata ga. Barra de escala, 100 nm.
Na vuli oqo e vakarautaka na ivakadinadina vakadodonu ena vivo ni lipid-yavutaki na protein ni iyaya e vakawasei ki na vanua ni vakau digitaki ena sala ni secretory, ka vakaraitaka na bibi ni balavu ni sinucodo ni acyl me baleta na digitaki ni vakawasoma. Vakayagataka e dua na iwalewale kaukauwa ka vakatokai na SCLIM, keitou vakaraitaka na Gas1-GFP vou (e dua na plasma levu ni GPI-AP kei na dua na sinucodo balavu sara ni acyl (C26) iwasewase ni lipid ni ceramide) ena leveni ) Na veivanua e vakasoqoni vata ena veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki ni veivakaduiduitaki ena ES, na ER ni veivakabulabulataki (iTaba 1). Me kena ikuri, na rua na mataqali iyaya oqo e curu duidui ERES digitaki (iTaba 2). Na balavu ni sinucodo ni acyl ni ceramide ni sela ena isema e vakalailaitaki mai na C26 ki na C18-C16, na ilawalawa ni kasi1-GFP e vakaleqai ki na vanua ni ER vakatikitiki, kei na kasi1-GFP e rerouted me biuta na ER vata kei na protein ni transmembrane ena ERES vata ga (irairai 3 kei na itaba3). 4).
E dina ga ni GPI-AP vakayagataka e dua na iwalewale ni protein vakatabakidua me biuta na ER, keitou kunea ni C26 ceramide-vakararavi na veibiu e sega ni vakararavi ena veimaliwai ni protein duidui ka rawa ni vakavuna na ERES vakatabakidua (iTaba S4 kei na S5). Ia, na noda kunea e tokona e dua na iwalewale ni veiwasei ni veisau e vakavuna na lipid-yavutaki na protein ni veisoqoni kei na kena muri na kena vakatabui na veika tale eso. Na noda raica e vakaraitaka ni vanua se ilawalawa ni Gas1-GFP e salavata kei na dua na ERES vakatabakidua e sega ni tiko kina na protein vakatikitikitaki ni Mid2-iRFP, ka vakaraitaka ni C26 ceramide-vakararavi GPI-AP ilawalawa ena vakarawarawataka na nodra curu ki na ERES veiganiti, kei na gauna vata oqori, sega ni okati kina na veivakacacani oqo Na Fig1 2). Ena kena veibasai, na kena tiko na C18-C16 ceramides ena ER ni ER e sega ni vakavuna na GPI-AP me bulia na veivanua se ilawalawa, me ra kakua kina ni vakatikitikitaka se sosomitaka na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ki na ERES vata ga (iTaba 3 kei na 4). . O koya gona, keitou vakatura ni C26 ceramide draiva na veibiu kei na veiwasei ena kena vakarawarawataki na veisoqoni ni protein e semati ki na ERES vakatabakidua.
Na sala me rawati kina na ilawalawa oqo ni C26 ceramide-vakararavi ki na dua na vanua ni ER vakatabakidua? Na ivakarau ni veisele ni veisele me wasei vakatikitiki e rawa ni vakavuna na GPI-AP kei na C26 veisele me ra bulia na lipids lalai ka vakatotolotaki ena vanua ni lipid sega ni tudei cake ni veisele ni ER e tiko kina na glycerolipids lekaleka ka sega ni vakasinaiti. Na ilawalawa ni ivakarau (17, 18). Na ilawalawa lalai vakalekaleka oqo e rawa ni fused tale ki na ilawalawa lelevu, tudei cake ni oti na kena vesuki ki na p24 vereverea (34). Me salavata kei na ka oqo, keitou vakaraitaka ni C26 Gas1-GFP e gadrevi me veimaliwai kei na p24 ni veivakatorocaketaki me buli kina na ilawalawa lelevu cake e laurai (itaba 3). Na p24 vereverea e dua na oligomer heterozygous e vakarautaki mai na va na duidui p24 transmembrane na protein ena leveni (35), ka vakarautaka na veivakadeitaki ni veivakadeitaki, ka rawa ni vakavuna na veivakadeitaki ni veivakadeitaki ni veivakadeitaki ni veivakadeitaki ni veivakadeitaki (34). Na veimaliwai ena maliwa ni ectodomains ni protein ni GPI-APs e rawa ni veivuke talega ki na nodra vakasoqoni vata, me vaka e vakaraitaki ena gauna ni nodra veivakau na Golgi ena veitiki ni yago ni manumanu susu (36). Ia, ni sa tiko na C18-C16 ceramide ena ER ni ER, ni sa vesuki na p24 vereverea ki na Gas1-GFP, ena sega ni buli na ilawalawa lelevu duidui. Na iwalewale e tiko kina e rawa ni vakatau ena veika vakayago kei na kemikali vakatabakidua ni ceramide balavu ni acyl senikau. Na vakadidike ni biophysical ni membranes buli e vakaraitaka ni dina ga ni rua na balavu (C24) kei na lekaleka (C18-C16) acyl sinucodo ceramides e rawa ni vakavuna na veibiu ni iwasewase, na ceramides balavu ga ni acyl sinucodo (C24) e rawa ni vakatorocaketaka na cecere ni curvature kei na iyaloyalo bending me vakavoutaka na iyaloyalo. Ena veivakatautauvatataki (17, 37, 38). Sa vakaraitaki ni helix ni transmembrane ni TMED2, na homologue ni tamata ni Emp24, digitaka na veimaliwai kei na C18 ceramide-yavutaki na sphingomyelin ena veivakacacani ni veivakacacani (39). Vakayagataka na veivakatautauvatataki ni veivakatautauvatataki ni veivakatautauvatataki (MD), keitou kunea ni rau kumuni vata ruarua na C18 kei na C26 ceramides wavolita na veivakatautauvatataki ni veivakatautauvatataki ni veivakatautauvatataki ni Emp24, ka rau sa tautauvata na nodrau gagadre (iTaba S6). E dodonu me da kila ni oqo e vakaraitaka ni helix ni transmembrane ni Emp24 e rawa ni vakavuna na veiwaseyaki ni asymmetric ni lipids ena veitiki ni yago. Oqo e dua na ka e se qai oti ga oqo e yavutaki ena sela ni manumanu susu. Na veivakatautauvatataki ni MD tautauvata e vakaraitaka talega na kena tiko na lipids ni ita (40) . O koya gona, eda vakasamataka ni C26 ceramide ena rua na lobules ni ER26 e vakavutuniyautaki ena vanua. Ni sa vesuki vakadodonu na GPI-AP ena loma ni luminal ki na p24 kei na kena kumuni na C26 ceramide wavolita na p24 ena loma ni cytoplasmic, e rawa ni vakatorocaketaka na kena vakasoqoni vata na protein kei na membrane curvaved era vakatuburi ena iqaqalo (41), ka vakavuna talega na GPI-AP me tawasei ki na vanua cecere, vanua ni ER ni ER (42). Na ripote sa oti e tokona na iwalewale e vakaturi (43, 44). Na vesuki ni multivalent ni oligolectins, na manumanu somidi se na veivakacacani ki na ceramide-yavutaki na glycosphingolipids (GSL) ena plasma ni plasma e vakavuna na GSL levu ni veivakasoqoni vata, vakalevutaka na veibiu ni iwasewase ka vakavuna na vakacacani ni membrane kei na kena vakacurumi (44). (43) E kunei ni ena kena tiko na sinucodo balavu (C24) ia e sega ni lekaleka (C16), na ligand multivalent e vauci ki na GSL lactosylceramide e vakavuna na kena tauyavutaki na veisoqosoqo lelevu kei na veivakacacani ni membrane, kei na veivakacacani ni sikinala ni veivakacacani ena veivakacacani ni veivakacacani.
Ena veitiki ni yago ni manumanu susu, na vakasama ni rede ni veivakacacani ni Golgi (TGN) ki na ivakatagedegede ni veitiki ni yago ni apical e lewa na veibiu kei na veiwasei ni GPI-AP (10, 45). Na vakasoqoni vata oqo e vakavuna na GPI-AP oligomerization (36), ia e rawa talega ni vakatau ena balavu ni sinucodo ni ceramide eda kunea ena leveni. E dina ga ni manumanu susu GPI-AP e dua na isema ni lipid-yavutaki ena ether, kei na kena ituvatuva ni kemikali e duidui sara mai na ceramide ni acyl balavu sara, e dua na vakadidike se qai oti toka ga e kunei ni rua na lipids e tautauvata na kena ivakarau vakayago kei na kemikali Kei na cakacaka (40). O koya gona, na tiki ni lipid ni ether ena sela ni manumanu susu e rawa ni tautauvata kei na C26 ceramide ena leveni, kei na kena itavi me veimaliwai kei na ceramide balavu-senikau ena membrane me vakatorocaketaka na GPI-AP vakasoqoni vata kei na veivakaduiduitaki. E dina ga ni rawa oqo e se gadrevi tikoga me vakatovolei vakadodonu, na veika e kunei taumada e tokona ni kena kau na ceramide balavu ni acyl sinucodo ki na yago ni Golgi e sega ni vakayacori mai na protein ni veisautaki ni cytoplasmic, ia e vakatau ena kena vakasoqoni vata na ikelekele ni GPI me vaka na leveni. O koya gona, na iwalewale ni veivakabulabulataki ni bula vakaidewadewa e vaka me rawa ni digitaki co-veitosoyaki balavu sara na acyl sinucodo ceramide kei na GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ena vesicle ni veivakavotukanataki vata ga.
Ena ivakarau ni sela ni sela ni leveni kei na manumanu susu, na GPI-AP kei na veibiu mai na so tale na protein ni plasma e yaco kece ni bera ni yaco yani ki na dela ni sela. Paladi kei na so tale. (48) kunei ni ena TGN ni manumanu susu polarized na sela ni epithelial, GPI-AP vakailawalawa e sega walega ni gadrevi me baleta na vakailawalawa digitaki ni GPI-APs ki na membrane ni plasma apical, ia e vakalawataka talega na isoqosoqo ni vakailawalawa ni GPI-APs kei na kena cakacaka vakayago. Na dela ni sela. Ena leveni, na vakadidike oqo e vakaraitaka ni C26 ceramide-vakararavi GPI-AP ilawalawa ena ER e rawa ni vakalawataka na isoqosoqo ni ilawalawa kei na cakacaka ni GPI-AP ena plasma ni plasma (24, 49). Me salavata kei na ivakaraitaki oqo, GhLag1 na sela era allergic ki na GPI veivakabulabulataki se wainimate e tara na yalodina ni bai ni sela (28), kei na kena gadrevi na cakacaka ni Gas1-GFP ilawalawa (49) ni ceramide ni ivakasala e vakaraitaki ena veiwatini ni sela ni leveni e vakaraitaka na G E rawa ni vakavuna na hLag1 na kena revurevu vakayago. Cala ni GPI-AP. Ia, na veivakatovolei tale eso se na isoqosoqo ni cakacaka ni dela ni sela sa parokaramutaki mai na ER ena dua na iwalewale ni veiwasei e yavutaki ena balavu ni lipid ena ulutaga ni noda vakadidike ena veisiga ni mataka.
Na veimataqali manumanu somidi e vakayagataki ena cakacaka oqo e volai tu ena Teveli S1. Na MMY1583 kei na MMY1635 na mataqali ni SCLIM me baleta na iyaloyalo ni sela bula era a tara ena taudaku ni W303. Na veimataqali oqo e vakaraitaka na Sec13-mCherry vata kei na dua na ivakatakilakila ni protein ni cina era a tara ena kena vakayagataki e dua na iwalewale ni veivakacacani ni veivakacacani (PCR)-yavutaki ena pFA6a plasmid me vaka e dua na ivakaraitaki (23). Na mataqali vakaraitaka na Mid2-iRFP vakatakilakilataki ena protein ni lumilumisa ena ruku ni lewa ni GAL1 veivakatorocaketaki a tara me vaka oqo. PCR amplification ni iRFP-KanMx veitarataravi mai na pKTiRFP-KAN vector (isolisoli ni E. O'Shea, na naba ni plasmid ni Addgene 64687; Ni oti na kena vakalevutaki na veitarataravi ni genome ni Mid2-iRFP ka vakacurumi ki na veivakatorocaketaki ni GAL1, a vakacurumi ki na sega ni au-Sac au vanua ni vakacurumi plasmid pRS306. Na plasmid pRGS7 e rawati e a vakarautaki vata kei na Pst au me vakacurumi ki na vanua ni URA3.
Na Gas1-GFP fusion gene e vakaraitaki ena ruku ni lewa ni GAL1 veivakatorocaketaki ena centromere (CEN) plasmid, ka sa tara me vaka oqo. Na ivakarau ni kasi 1-GFP a vakalevutaki ena PCR mai na pRS416-kasi 1-GFP (24) (isolisoli ni L. Popolo) ka vakatautauvatataki ki na Xma au-Xho au vanua ni CEN plasmid pBEVY-GL LEU2 (isolisoli ni C) . Mila; Na naba ni palasimidi ni ikuri 51225; 51225; RRID: Vakacurumi_51225). Na palasimidi e rawati e vakatokai me pRGS6. Na Axl2-GFP fusion gene e vakaraitaki talega ena ruku ni lewa ni GAL1 veivakatorocaketaki ni pBEVY-GL LEU2 vector, kei na kena tara e vakaoqo. Na veitarataravi ni Axl2-GFP a vakalevutaki mai na pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) ena PCR, ka vakatautauvatataki ki na vanua ni Bam HI-Pst au ni pBEVY-GL LEU2 vector. Na palasimidi e rawati e vakatokai me pRGS12. Na veitarataravi ni oligonukleotides e vakayagataki ena vakadidike oqo e volai tu ena Teveli S2.
Na mataqali a vakaikuritaki ena 0.2% adenine kei na 2% suka [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose] vutuniyau na leveni lavetaki na protein p (YP) veimama (1% leveni lavetaki kei na 2% na leveni ept). (YPR)] se 2% galactose [YP-galactose (YPG)] me vaka e dua na ivurevure ni kaboni, se ena dua na ivakarau lailai duadua ni veivakacacani (0.15% yavu ni nitrogen ni leveni kei na 0.5% amoniumi sulfate) me vakaikuritaka na amino asidi veiganiti kei na yavu e gadrevi me baleta na kakana , Ka tiko kina na 2% galactose lailai2% suka) (galactose vakaitamera lailai duadua) me vaka e dua na ivurevure ni kaboni.
Me baleta na gauna dina ni iyaloyalo, na ivakarau ni katakata-vakasamataki sec31-1 na sela ni mutant vakaraitaka na tara ena ruku ni GAL1 veivakatorocaketaki era a tubu ena YPR veimama ena 24 ° C ena bogi ki na lomadonu ni iwasewase ni log. Ni oti na kena vakacurumi ena YPG ena 24°C me baleta na 1 na auwa, era a vakacurumi na sela ena SG ena 37°C me baleta na 30 na miniti, ka qai vakadewataki ki na 24°C me sereki mai na buloko ni veivakabulabulataki. E vakayagataki na Concanavalin A me vakavinakataki kina na sela ena dua na iloilo ni iloilo ka vakaraitaki ena SCLIM. SCLIM e dua na isoqoni ni Olympus IX-71 veisautaki na matailoilo ni fluorescence kei na UPlanSApo 100 × 1.4 na matailoilo ni waiwai ni matailoilo (Olympus), totolo cecere kei na cecere-sikinala-ki-na rorogo ratio veisautaki disiki confocal ivakarau (Yokogawa vakalivaliva kei na itovo vakavanua), (Hamamatsu itaba) e rawa ni vakarautaka e dua na ivakarau ni matailoilo vakalevutaki kei na dua na iotioti ni vakalevutaki ni × 266.7 kei na dua na itaba ni iyaya ni sausaumi-vakaveiwekanitaki ka vakalevutaka na elekitironiki (Hamamatsu itaba) (21). Na rawati ni iyaloyalo e vakayacori ena parokaramu ni komipiuta vakaitaukei (Yokogawa livaliva). Me baleta na iyaloyalo 3D, keitou vakayagataka e dua na ivakarau ni piezoelectric me vakayavalata na matailoilo ni inaki vakadodonu, ka soqona na veitiki ni mata 100 nm vakatikitiki ena dua na itutu. Na iyaloyalo ni Z-itukutuku e veisautaki ki na itukutuku ni voxel 3D, kei na cakacaka ni veisoliyaki ni tikina vakasama e vakayagataki me baleta na misini ni veisautaki ni disiki e vakayagataki me baleta na cakacakataki ni deconvolution mai na parokaramu ni komipiuta ni Volocity (PerkinElmer). Ena kena vakayagataki na parokaramu ni komipiuta ni Volocity me vakataki koya na icurucuru me baleta na vakadidike ni co-vanua, ERES oka kina na iyaya e vakarautaki. Na vakadidike ni laini ni vakadidike e vakayacori ena kena vakayagataki na parokaramu ni komipiuta ni MetaMorph (iyaya ni molecule).
Vakayagataka na parokaramu ni komipiuta ni GraphPad Prism me vakadeitaka na bibi ni iwiliwili. Me baleta na rua-tailed ni gonevuli t-vakatovolei kei na ivakarau ni dua na sala ni vakadidike ni veisau (ANOVA) vakatovotovo, duidui ena maliwa ni ilawalawa e vakasamataki me dua na kena revurevu bibi ena P <0.05 (*).
Me baleta na fluorescence ni vakadidike ni Gas1-GFP, na sela ni iwasewase ni kau era a tubu ena bogi ena YPD ka vakasoqoni vata ena veivakasavasavataki, savati vakarua ena phosphate buffered saline, ka vakatuburi ena aisi me baleta na lailai duadua ni 15 na miniti, ka qai toso ena ruku ni vakadidike me vaka e vakamacalataki taumada (Check24). Na Leica DMi8 maikorosikopu (HCX PL APO 1003/1.40 waiwai PH3 CS) vakaiyaragitaki ena dua na matailoilo ni inaki, L5 (GFP) vakasavasavataki, Hamamatsu itaba kei na ivolakerekere Suite X (LAS X) parokaramu ni komipiuta a vakayagataki me baleta na kena rawati. .
Na ivakaraitaki era a vakacacani ena SDS ivakaraitaki ni buffer ena 65 ° C me baleta na 10 na miniti, ka qai wasei ena SDS-poliacrylamide gel vakalivaliva (PEPA). Me baleta na vakadidike ni veivakabulabulataki, 10 μl ni ivakaraitaki e vakavodoki ena dua na sala. Na imatai ni veivakabulabulataki: Vakayagataka na rapiti ni veivakabulabulataki ni 1:3000, na veivakabulabulataki ni rapiti ni veivakabulabulataki ni 1:500, kei na veivakabulabulataki ni rapiti ni veivakabulabulataki ni GFP (e dua na isolisoli mai vei H. Riezman) ena dua na veivakabulabulataki ni 1:300. Na kalavo monoclonal ni veivakacacani ni Pgk1 a vakayagataki ena dua na vakalailaitaki ni 1: 5000 (e dua na isolisoli mai vei J. iKarua ni veivakabulabulataki: Na veivakabulabulataki ni me veivakabulabulataki ni rapiti G (IgG) e vakayagataki ena dua na vakalailaitaki ni 1: 3000 (Pierce). HRP-vakaduavatataki me anti-mouse IgG a vakayagataki ena dua na vakalailaitaki ni 1: 3000 (vakacacani). Na vanua ni isau ni itataqomaki a raica na iwalewale ni chemiluminescence ni SuperSignal Tokalau Pico vakasaenisi (vakasaenisi ni dauqoli katakata).
Me vaka e vakamacalataki ena (31), e dua na vakatovotovo ni veivakabulabulataki vakayago e vakayacori ena iwasewase ni ER vakavutuniyautaki. Me vakalekalekataki, savata na sela ni leveni kei na TNE buffer [50 mm tris-HCl (pH 7.5), 150 mm nacl, 5 mm EDTA, 1 mm na fluoride kei na veiwaki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki) ena 600 nm ( OD600 vakarua) ena 100 vakarua. E musuki ena bilo, oti sa qai kau laivi na benu ni sela kei na bilo ena kena vakayagataki na centrifugation. Na wai e cake e qai vakasavasavataki ena 17,000 g me baleta na 15 na miniti ena 4°C. Na peleti e a vakavoutaki tale ena TNE ka sa vakacurumi na saponin digitaki ki na dua na iotioti ni vakasama ni 1%. Na vakacegu e a vakamamacataki me baleta na 1 na auwa kei na veisau ena 4°C, ka qai kau laivi na veitiki ni sega ni vakawaicalataki ena kena vakayagataki na 13,000 g ena 4°C me baleta na 60 na miniti. Me baleta na immunoprecipitation ni Gas1-GFP, taumada ni bera ni vakatuburi na ivakaraitaki ena lala ni agarose beads (ChromoTek) ena 4 ° C me baleta na 1 na auwa, ka qai vakatuburi vata kei na GFP-Dau_A (ChromoTek) ena 4 ° C me baleta na 3 na auwa. Na veitiki ni immunoprecipitated era a savati vakalima ena TNE e tiko kina na 0.2% digoxigenin, vakasavasavataki ena ivakaraitaki ni SDS, wasei ena SDS-PEPA, ka vakadikevi ena immunoblotting.
Me vaka e vakamacalataki ena (31), na vakatulewa ni veitaratara ni kauveilatai e vakayacori ena iwasewase ni ER vakavutuniyautaki. Vakalekaleka, na iwasewase ni ER vakavutuniyautaki a vakatuburi vata kei na 0.5 mM dithiobis (vakacaca, vakasaenisi ni dauqoli katakata, Rockford, IL, Amerika; 20 ° C, 20 na miniti). Na veivakacacani ni veivakacacani e vakamatei ena kena vakacurumi na glycine (50 mM iotioti ni vakasama, 5 na miniti, 20 ° C).
Me vaka sa vakamacalataki oti (50), MS vakadidike ni ceramide ena manumanu-mataqali kei na GhLag1 veimataqali a vakayacori. Me vakalekalekataki, era a tubu na sela ki na iwasewase ni vakaraitaki (3 ki na 4 OD600 na iuniti/ml) ena YPD ena 30 ° C, kei na 25 × 107 na sela era a tamusuki. Na nodra veisautaki ni yago e bokoci ena asidi ni trikoloroasetiki. Vakayagataka na vakasavasavataki ni extraction [ethanol, wai, ether, pyridine kei na 4.2 N amonium hydroxide (15: 15: 5: 1: 0.018 v / v)] kei na 1.2 nmol ni ivakatagedegede ni loma C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) vinaka). Vakayagataka na monomethylamine reagent [methanol, wai, n-butanol kei na iwali ni methylamine (4: 3: 1: 5 v / v)] me vakayacori kina na hydrolysis malumu ni alkaline ni vakasaqa, ka qai vakayagataka na wai-vakasinaiti n-butanol me desalt. Kena itinitini, na vakasukasuka a vakasukai tale ena dua na ivakarau vinaka ni veivakabulabulataki [cloroform / methanol / wai (2: 7: 1) + 5 mM amoniumi acetate] ka vakacurumi ki na spectrometer ni levu. E vakayacori na vakadidike ni veivakacacani e vuqa (MRM) me baleta na kena kilai kei na kena vakarautaki na veitiki ni sphingolipid. Na TSQ Vinaka na ikatolu ni quadrupole levu ni spectrometer (Thermo dauqoli vakasaenisi) sa vakarautaki tu ena dua na robot nanoflow ion ivurevure Nanomate HD (iVakasala Biosciences, Ithaca, NY) me baleta na vakadidike ni lipid. Na kaukauwa ni veicoqacoqa e vakavinakataki me baleta na veimataqali ceramide yadua. Na itukutuku ni MS e rawati ena ivakarau vinaka. Me baleta na veivakatautauvatataki yadua ni bula, na sikinala ni lipid sa ikoya na median ni tolu na veivakatovolei tudei.
Me vaka e vakamacalataki ena (31), na sela (800 × 107) vakaraitaka na kasi1-GFP era a vakayacori ki na veivakabulabulataki vakayago. Na vakasavasavataki ni kasi1-GFP a wasei mai na SDS-PEPA ka vakadewataki ki na dua na kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa (PVDF). Na protein e vakaraitaki ena kena vakasinaiti na PVDF ena amide karakarawa. Na ilawalawa ni Gas1-GFP a musuki mai na PVDF ka savati 5 na gauna ena methanol kei na dua na gauna ena wai ni kalasi ni wai-MS (LC-MS). Ena kena vakatuburi na ilatilati ni membrane kei na 500 μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), buffer kei na 500 μl vou vakawabokotaki 1 M na sodium nitrite veiwaki ena 37 ° C me baleta na 3 na auwa, na iwasewase ni lipid e vagalalataki mai na kasi 1-GFP kei na lysed inophasa sereki ni cera (51). Ni oti o ya, na membrane ni ilawalawa e a savati vakava ena wai ni kalasi ni LC-MS, vakamamacataki ena katakata ni rumu, ka maroroi ena dua na draki ni nitrogen ena -80°C me yacova na vakadidike. Me vaka e dua na lewa, e dua na ivakaraitaki lala ni PVDF membrane a vakayagataki me baleta na veivakatovolei yadua. Na lipid e lavetaki mai na kasi1-GFP a qai vakadikevi mai na MS me vaka e vakamacalataki (50). Me vakalekalekataki, na veitiki ni PVDF e tiko kina na GPI-lipid era a vakasukai tale ena 75 μl na veivakacacani ni veivakacacani [1: 2) + 5 mM ni veivakacacani ni veivakacacani (ESI) - MRM / MS vakadidike ni veimataqali sphingolipid (TSQ Vantage). Ena kisi oqo, a rawati na itukutuku ni MS ena ivakarau ni ion ca.
Me vaka sa tukuni oti, na iwase ni lipid ni iyaya ni GPI a tawasei mai na [3H] -inositol-vakatakilakilataki GPI-AP (16). Na lipids era a wasei ena kena vakayagataki e dua na ivakarau ni veivakabulabulataki (55: 45: 10 chloroform-methanol-0.25% KCl) ka vakaraitaki ena kena vakayagataki na FLA-7000 (Fujifilm).
Na sela vakaraitaka na Gas1-GFP (600 × 107) era a savati vakarua ena TNE ni veivakabulabulataki kei na TNE ni veivakabulabulataki, ka musuki ena bilo bilo, ka qai centrifuged me kau laivi na benu ni sela kei na bilo bilo. Na wai e cake e qai vakasavasavataki ena 17,000 g me baleta na 1 na auwa ena 4°C. Na peleti a savati ena TNE ka vakatuburi vata kei na 1 U PI-PLC (Invitrogen) ena TNE e tiko kina na 0.2% digitaki saponin me baleta na 1 na auwa ena 37 ° C. Ni oti na veiqaravi ni enzyme, a kau laivi na membrane ena kena vakayagataki na 17,000 g ena 4°C me baleta na 1 na auwa. Me vakabulabulataki na kasi 1-GFP, na supernatant a vakasucumi vata kei na GFP-ilawaki_A (ChromoTek) ena 4 ° C ena bogi taucoko. Na vakasavasavataki ni kasi1-GFP wasei mai na SDS-PEPA a vakasinaiti ena Coomassie karakarawa kaukauwa. Na ilawalawa ni veivakacacani ni Gas1-GFP a musuki tani mai na vulavula e wavolita na sala ni wai, ka qai oti na kena vakayagataki na iodoacetamide kei na kena vakalailaitaki na dithiothreitol, a vakayacori na veivakasavasavataki ena-gel kei na trypsin. Lavetaka ka mamaca tryptic peptides kei na peptides vata kei na GPI-glycans. Na peptide mamaca e vakawaicalataki ena 20 μl ni wai. Vakacuruma e dua na iwase (8μl) ki na LC. E dua na duru ni octadecylsilane (ODS) (vakatorocaketaka na 300ODS-HG-5; na kena rabailevu e loma 150 mm × 1.0 mm; Nomura kemikali, yasana o Aichi, Japani) a vakayagataki me wasei kina na peptides ena ruku ni ituvaki ni gradient vakatabakidua. Na iwasewase ni talevoni veikauyaki sa ikoya na veivakabulabulataki A (0.08% vakalivaliva) kei na veivakabulabulataki B (0.15% vakalivaliva ena 80% asetonitrile). E dua na ivakarau ni HPLC ni Accela (Thermo Fisher vakasaenisi, Boston, Massachusetts) a vakayagataki me elute na duru kei na waigaga A ena loma ni 55 na miniti ena dua na drodro ni 50 μl min-1 me baleta na 5 na miniti, ka qai vakalevutaki na vakasama ni waigaga B ki na 40%. , Amerika). Na eluate a tomani tikoga na kena vakacurumi ki na ivurevure ni ion ni ESI, kei na tryptic na peptides kei na peptides vata kei na GPI-glycans era a vakadikevi mai na LTQ vakacaca XL (vakacaca ni vakacaca ni vakacaca ni vakacaca-vakacaca ni vakacaca; Thermo dauqoli vakasaenisi). Ena ituvatuva ni MS, na volitika ni ivurevure ni kapila e vakarautaki ki na 4.5 kV, kei na ivakarau ni katakata ni kapila ni veisau e maroroi ena 300°C. Na kaukauwa ni capillary kei na kaukauwa ni matailoilo ni tube era a vakarautaki ki na 15 V kei na 50 V, vakatautauvata. MS itukutuku a rawati ena ivakarau ni ion vinaka (vakatulewa ni 60,000; dodonu ni levu ni 10 na iwase ena dua na milioni) ena dua na levu ni 300/m/z levu/sausaumi ratio (m/z) 3000. veivakacacani e vakavuna na veivakacacani (CID)].
MD vakatovotovotaki a vakayacori ena kena vakayagataki na parokaramu ni komipiuta ni GROMACS (52) kei na vanua ni kaukauwa ni MARTINI 2 (53-55). Na CHARMM GUI ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki (56, 57) a qai vakayagataki me tara kina e dua na bilayer e tiko kina na veivakabulabulataki (DOPC) kei na Cer C18 se DOPC kei na Cer C26. Na topology kei na veitaratara ni Cer C26 e rawati mai na DXCE ena kena kau laivi na ikuri ni beads mai na iqaqalo ni sphingosine. Vakayagataka na iwalewale e vakamacalataki e ra me vakatautauvatataki kina na ilawalawa vakarua ka vakaciciva, qai vakayagataka na iotioti ni coordinates ni ivakarau me tara kina e dua na ivakarau e tiko kina na Emp24. Na vanua ni transmembrane ni leveni Emp24 (vakavotui 173 ki na 193) a tara me vaka e dua na α-helix ena kena vakayagataki na iyaya ni cakacaka ni MD (VMD) ni iyaya ni cakacaka (58). Oti, ni oti na kena kau laivi na lipids ni veicurumaki, na protein e a vakacacani vakalevu ka vakacurumi ki na bilayer ena kena vakayagataki na CHARMM GUI. Na iotioti ni ivakarau e tiko kina na 1202 DOPC kei na 302 Cer C26 se 1197 DOPC kei na 295 Cer C18 kei na Emp24. Ionize na ivakarau ki na dua na vakasama ni 0.150M. E va na vakatovotovo tudei e caka me baleta e rua na ibulibuli ni bilayer.
Na bilayer ni lipid e vakatautauvatataki ena kena vakayagataki na iwalewale ni CHARMM GUI, ka oka kina na kena vakalailaitaki ka qai vakatautauvatataki na 405,000 na ikalawa, na vanua e vakalailaitaki kina vakamalua na itutu ni veivakataotaki ka vakaoti, kei na ikalawa ni gauna e vakalevutaki mai na 0.005 ps ki na 0.02 ps. Ni oti na veivakatautauvatataki, e vakavuna na 6 μs kei na dua na ikalawa ni gauna ni 0.02 ps. Ni oti na kena vakacurumi na Emp24, vakayagataka na iwalewale vata ga ni CHARMM GUI me vakalailaitaka ka vakatautauvatataka na ivakarau, ka qai cici me baleta na 8 s ena buli.
Me baleta na ivakarau kece, ena gauna ni veivakatautauvatataki, na veivakasaurarataki e lewa na Barendsen (59), kei na gauna ni buli iyaya, na veivakasaurarataki e lewa na Parrinello-Rahman (60). Ena veituvaki kece, na ivakatautauvata ni veivakasaurarataki e 1 na bara kei na dua na ituvatuva ni veivakasaurarataki ni veivakasaurarataki ni semi-isotropic e vakayagataki. Ena veivakatautauvatataki kei na iwalewale ni buli, e dua na ivakarau ni katakata (61) kei na totolo ni recalibration e vakayagataki me veiwatini kina na ivakarau ni katakata ni protein, lipid kei na veitiki ni veivakabulabulataki vakatautauvata. Ena gauna taucoko ni cakacaka, na takete ni katakata e 310K. Na veimaliwai sega ni veiwekani e vakarautaki ena kena vakatuburi e dua na lisi ni veiwatini ena kena vakayagataki na ituvatuva ni Verlet kei na 0.005 vosota ni buffer. Na vosa ni Coulomb e vakarautaki ena kena vakayagataki na vanua ni veivakacacani kei na dua na yawa ni 1.1 nm. Na vosa ni Vander Waals e vakayagataka e dua na ituvatuva ni veisele kei na dua na veisele ni 1.1 nm, kei na ituvatuva ni veisele ni Verlet e vakayagataki me baleta na rawa ni drodro (62).
Vakayagataka na VMD, na kaukauwa ni cutoff ena maliwa ni DOPC phosphate kaukauwa se ceramide AM1 kaukauwa kei na protein e 0.7 nm, kei na iwiliwili ni lipids e veimaliwai kei na protein e vakarautaki. Me vaka na fomula oqo, vakarautaka na vakalailaitaki-vakavutuniyautaki (DE) na ka me vaka ena (63): DE na ka = (na levu ni lipids taucoko ena protein 0.7) ena protein 0.7 (na levu ni Cer ena lipids taucoko) .
Na ripotetaki ni isau e rawati me vaka e dua na ivakatautauvata, kei na cala ni bars e va na ilavelave tudei ni SE. Na bibi ni iwiliwili ni DE na ka e vakarautaki ena t vakatovotovo [(ivakarau ni DE-ka-1) / SE]. Vakarautaka na P na isau mai na veiwasei ni dua na-tailed.
Na iyaya ni cakacaka ni GROMACS a vakayagataki me vakarautaki kina na mape ni 2D ni kaukauwa ni kaukauwa ni ivakarau e tiko kina na Emp24 ena loma ni iotioti ni 250 ns ni vakadidike. Me rawa ni rawati na mape ni vakavutuniyautaki/vakalailaitaki ni ceramide, na mape ni density ni Cer e wasei ena isoqoni ni mape ni Cer kei na DOPC, ka qai wasei ena vakasama ni Cer ena yago. E vakayagataki na ivakarau ni mape ni roka vata ga.
Me baleta na ikuri ni iyaya me baleta na itukutuku oqo, yalovinaka raica na http.
Oqo e dua na itukutuku ni rawa-ka e dolavi ka veisoliyaki ena ruku ni veivakadonui ni Creative Commons Attribution-Sega ni Veivoli Laiseni, ka vakatara na kena vakayagataki, veisoliyaki kei na kena vakadewataki ena dua na sala, me vaka ga ni iotioti ni kena vakayagataki e sega ni baleta na rawa-ka vakabisinisi kei na premise sa ikoya na cakacaka taumada e dodonu. Ivakatakilakila.
iVakamacala: Keitou kerei iko ga mo vakarautaka na nomu itikotiko ni imeli me rawa kina vua na tamata o vakatura ki na tabana e kila ni o vinakata me ra raica na imeli ka sega ni spam. Eda na sega ni taura e dua na itikotiko ni imeli.
Na taro oqo e vakayagataki me vakatovolei kina se o iko e dua na dausiko vanua ka tarova na vakau ni spam vakataki koya.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Mirgihope Logigao (Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D cecere-vakatulewa ni gauna dina ni iyaloyalo e vakaraitaka na bibi ni balavu ni sinucodo ni ceramide me baleta na veiwasei ni protein ena vanua ni output digitaki.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Mirgihope Logigao (Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D cecere-vakatulewa ni gauna dina ni iyaloyalo e vakaraitaka na bibi ni balavu ni sinucodo ni ceramide me baleta na veiwasei ni protein ena vanua ni output digitaki.
©2020 iSoqosoqo ni Amerika me baleta na Toso ki liu ni Saenisi. dodonu kece e maroroi. AAAS es un partner de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef y COUNTER. Na toso ki liu ni saenisi 2375-2548.