Vinaka vakalevu na nomu sikova na Nature.com.Na ivakarau ni barausa o vakayagataka tiko e vakaiyalayala na veitokoni me baleta na CSS.Me baleta na veika vinaka e sotavi, keitou vakatura mo vakayagataka e dua na barausa vakavoutaki (se bokoca na ivakarau ni veiganiti ena Initaneti Explorer).Ena gauna oqo, me vakadeitaka na veitokoni tomani tikoga, keitou na vakaraitaka na vanua ka sega na ivakarau kei na JavaScript.
E sega ni vakataki ira na manumanu lalai, era nanuma raraba ni manumanu lalai e sega vei ira na homoni ni veiyacovi vakatagane. Na kena vakatorocaketaki na yaloka kei na veiwatini era itovo bibi ni vakaluveni, na kena kilai na sala era vakaduavatataka kina na namu yalewa na Anopheles na sikinala oqo e rawa ni vakarawarawataka na kena tuvanaki na parokaramu vou ni kena lewai na malaria. 3-dehydro-20E (3D20E), ka taqomaki ira na itubutubu ena kena sogoti na veivakadonui ni veiyacovi yalewa ni oti na veisau ni veiyacovi kei na kena vakavotukanataki ena dephosphorylation. 20E e sega ni vakavuna e dua na isau ni veiyacovi, ia e vakatara na tamata yadua me ra vakaluveni ni oti na kena vakatabui na kinases ni 20E-inhibiting. na nodra rawa ni vakaluveni na namu era dau vakadewa na malaria.
Sa tubu tale tikoga na kisi ni malaria kei na mate4 ena vuku ni kena sa takalevu sara na kena vorati na manumanu lalai na namu Anopheles, na manumanu lalai duadua ga e dau vakadewa na manumanu lalai ni tamata. na kena caka na soqo ni veiwatini duadua oqo me sega ni vakaluveni ena rawa ni vakalailaitaka na iwiliwili ni namu ena vanua ni teitei.
Era sa sega ni rawa ni veiyacovi na marama ni oti na nodra ciqoma na veivakabulabulataki cecere mai vei ira na tagane. Na veimataqali Anopheles ka ra tiki ni subgenus Cellia7, ka sa veisoliyaki e Aferika ka okati kina na vectors rerevaki duadua ni malaria, oka kina na Anopheles gambiae. ena kena vakaduavatataki na marama na sikinala mai na rua na ivurevure duidui ni ecdysone (veisau ni tagane kei na induction ni kana dra) ka sega ni vakaleqa na nodra rawa ni veiwatini.Na kena dina, kevaka na 20E e vakayacora na marama e vakavuna na sega ni vosota ni veiyacovi, oqo ena vakavuna na sega ni vakaluveni ena goneyalewa-vakani na tamata yadua, e dua na itovo oqo e dau yaco vakalevu ena5.
E dua na ivakamacala e rawa ni A. gambiae tagane vakadewataka e dua na veisautaki tagane-vakatabakidua ecdysone, ka vakayacora e dua na cascade ni sikinala ena sala ni vakasucu yalewa, ka vakavuna na sega ni dei ni veiwatini. steroids e sega ni laurai ena manumanu lalai.
Eda sa vakarautaka me vakadeitaka na repertoire ni steroid hormones ena tagane tagane iyaya ni gland (MAG) ni veiyacovi matua A. gambiae ena vakasaqaqara ni rawa ni veisautaki na steroids. ena tikina oqo, vakadeitaka na kena isau sa oti.Ia, na ivakaraitaki a lewai mai na steroids phosphorylated oxidized, salavata kei na fomula 3-vakacacani-20E-22-fosphate (3D20E22P)12 (iTaba 1). (20E22P).Na HPLC-MS / MS sikinala kaukauwa ni 3D20E22P e rua na ota ni levu cake mai na kena fomu dephosphorylated, 3D20E, kei na tolu na ota ni levu cake mai na kena ni E kei na 20E (iTaba 1). 1a).Keimami vakadikeva talega na ecdysteroids ena vou sogo (<1 siga makawa) tagane kei na yalewa ka kunea na 3D20E kei na 3D20E22P duadua ga ena MAG; E, 20E kei na 20E22P era a tiko ena veiwatini ruarua (itukutuku vakabalavutaki Fig. 1b).Na itukutuku oqo e vakaraitaka ni A. gambiae tagane qase e vakatubura na titers cecere ni veisautaki ni homoni ena nodra MAGs ka sega ni vakarautaki mai vei ira na yalewa.
MAG kei na LRT yalewa (oka kina na atria, vesicles ni seminal, kei na parovarium) era a vakacacani mai na 4-siga-yabaki (4-siga-yabaki) tagane goneyalewa kei na goneyalewa kei na yalewa vakawati (0.5, 3, kei na 12 hpm). na iwiliwili ni kunei (FDR) vakadodonutaki; NS, sega ni bibi; * P <0.01 . 3D20E22P: 3 na auwa kei na 0.5 na auwa, P = 0.25; 12 na auwa kei na 3 na auwa, P = 0.0032; 12 na auwa kei na 0.5 na auwa, P = 0.015). namu.Ecdysone e vakaraitaki ena roka me vaka oqo: E, dromodromo; 20E, moli; 20E22P, damudamu; 3D20E, karakarawa; 3D20E22P, roka damudamu.Na vakacurumi e vakalevutaka na ivakarau ena y-axis me vakaraitaka na ivakatagedegede ni ecdysone lailai.
Me vakadikevi se ra sa vakadewataki na 3D20E22P kei na 3D20E ena gauna ni veiwatini, keitou a vakasavasavataka na LRTs yalewa ena veigauna duidui ni oti na veiwatini. gauna, ni 3D20E na ivakatagedegede e tubu vakalevu (iVakaraitaki. 1).Vakayagataka na kemikali ni 3D20E me vaka e dua na ivakatagedegede, keitou vakadeitaka ni ivakatagedegede ni steroid oqo ena veiwatini LRTs e lailai duadua 100-vakacacani cecere cake mai na 20E (Teveli ni itukutuku vakabalavutaki 1). yalewa LRT ena gauna ni veiwatini, kei na kena fomu ni vakawati, 3D20E, sa yaco me levu sara ni oti toka ga na veiwatini.Oqo e vakaraitaka e dua na itavi bibi me baleta na iotioti ni ecdysone ena marama ni oti na veiwatini ni bula.
Ni oti na kena vakatuburi e dua na itukutuku vou ni RNA sequencing (RNA-seq) (iVakaraitaki. 2a), ena kena vakayagataki e dua na paipo ni bioinformatics vakaitaukei, keitou a vakasaqara na kinase ni ecdysone (EcK), ecdysone oxidase (EO), kei na ecdysone encoding 20E-veisautaki na phosphatase vakatakilakilataki e dua na gene. EPP genes kei na rua na rawa ni EcK genes (EcK1 kei na EcK2), ia era sega ni rawa ni kunea e dua na EO genes vinaka. oqo na yago ni yalewa.O koya gona, keitou vakabauta ni tagane EPP e rawa ni vakadewataki ena gauna ni veiwatini.E dina sara, keitou vakayagataka ena vivo tudei na isotope vakatakilakilataki me ubia na protein ni yalewa ni oti na veiwatini, e dua na enzyme e vakatakilakilataki mai na MS ena atrium ni yalewa (iVakaraitaki. 2c kei na ikuri ni Teveli ni LPP a sega ni mafele 1). vakadeitaki ena kena vakayagataki na veivakabulabulataki vakatabakidua (iTaba 2d).
a, E dua na paipo ni bioinformatics vakaitaukei me vakasaqara na veitiki ni vakasucu ni veiwatini yadua me baleta na genes encoding EcKs, EOs, kei na EPPs. tagane, kei na dua na gene ni EcK (EcK2) ka vakaraitaki ena veiwatini ruarua ia e sega ni rawata e dua na gene ni EO ni veidigitaki.b, Mape ni katakata e vakatauvatana na gene ni veidigitaki ena goneyalewa (V) kei na veiwatini (M) na veitiki ni yago ni Anopheles gambiae kei na Anopheles albicans.Spca, vakaluveni; MAGs, na gland ni veivuke ena tagane; eso tale na tiki ni yago, oka kina na sucu, tabana, yava, yago uro, kei na gacagaca e loma ena veiwatini ruarua, kei na ovaries ena yalewa. hpm, vakaraitaka na 67 na levu duadua ni protein.Era a susugi cake na yalewa ena dua na kakana e tiko kina na 15N me vakatakilakilataki (kei na matavulo) na protein kecega. EPP a kunei ena MAG ni tagane goneyalewa ena vakadidike ni proteomic ni veitikina oqo. anti-EPP antibodies.Na tagane kece era goneyalewa.Raica na ikuri ni itaba 1 me baleta na itukutuku ni ivurevure ni gel.E vakayacori vakarua na blots ni tokalau kei na kena isau tautauvata.
Na cakacaka ni ecdysteroid phosphosphatase ni EPP a vakadeitaki ni oti na kena vakatuburi na HPLC-MS / MS kei na 3D20E22P vakatikitikitaki mai na MAG (itukutuku vakabalavutaki Fig. 2a). (iVakaraitaki. 3a), kei na yalewa mated vata kei na tagane EPP-vakanomodi vakaraitaka na bibi E dua na iwase lailai ni dephosphorylated 3D20E (iVakaraitaki. 3b) dina ga ni vakatikina na gene vakanomodi (Itukutuku vakabalavutaki Fig. 2b, c). vakatura ni sa vakatabakidua na enzyme me baleta na 3D20E22P (iVakaraitaki. 3b).
a, Vakalailaitaka na cakacaka ni phosphatase ena MAG e vakavuna na EPP vakanomodi ena kena vakayagataki na EPP RNA vakarua (dsEPP) se vakarua na GFP RNA (dsGFP) lewa. veiwatini kei na tagane EPP-vakanomodi e dua na iwiliwili lailai sara ni 3D20E ena 3 hpm (P = 0.0043, sega ni veiwatini t-vakatovotovo, rua na yasana), ia na ivakatagedegede ni 20E e sega ni vakaleqai (P = 0.063, sega ni veiwatini). t-vakatovolei, rua na yasana).Na itukutuku e vakaraitaki me vaka na ibalebale ± sem mai na tolu na tobu ni 13, 16 kei na 19 na yalewa yadua.c, Na yalewa era veiwatini kei na tagane EPP-vakanomodi e tiko vei ira na iwiliwili cecere sara ni veiwatini tale (P = 0.0002, na veivakatovolei dodonu ni Fisher ki na nodra ituvaki ni veiwatini ki na imatai ni yasana; 2 siga e muri, era a veitaratara kei na so tale na tagane era kauta tiko na sperm ni transgenic me ra vakadikeva na iwiliwili ni veiwatini tale ena kena kunei na PCR ni veiwatini. 0.088, veivakatovolei ni Mann-Whitney, rua na yasana) , ni sega ni vakaleqai na iwiliwili ni vakasucu (P = 0.94, veivakatovolei dodonu nei Fisher, rua na yasana). P <0,001.
Tarava, keitou vakadikeva se bibi na ecdysone dephosphorylation me baleta na kena vakavuna na veivakacacani ni veimaliwai ena marama. vakaluveni (iVakaraitaki. 3d, imawi) kei na dua na lailai sobu ni iwiliwili ni yaloka era vakadavora na marama oqo (iVakaraitaki. 3d, lomadonu), ni pasede ni yaloka era vakadavora na yalewa (e dua tale na isaunitaro elicited ena marama ena veiwatini )) era sega ni vakaleqai (iVakaraitaki. 3d, oqoserved). vakatura ni kena vakayacori na 3D20E mai na EPP vakadewataki ena gauna ni veiwatini e rawa ni dua na itavi bibi ena kena bokoci na ciqomi ni yalewa me tomani tale na veiwatini, e dua na itovo e liu ascribed ki na veisau ni veiyacovi ni 20E .O koya gona, oqo na tagane-vakatabakidua na hormone talega e kaukauwa sara na kena tarai na vakaluveni ni yalewa.
Tarava, keitou vakatauvatana na itaviqaravi ni 20E kei na 3D20E ena veivakatovolei ni veisele ena goneyalewa matua vakaveiwatini ena kena vakayagataki na 3D20E (iVakaraitaki. 4a-c) kei na 20E. (Itaba. 4d).Vakabibi, veimama na ivakatagedegede ni yago ni 3D20E ena LRT (1,066 pg ni oti na veisele vs. 2,022 pg ni oti na veiwatini) vakavuna e dua na iwase ni marama refractory ka sa 20-vakacaca cecere cake mai na ivakatagedegede ni yago ni 20E ni oti na veisele-3. na vakasama cecere duadua 18 pg ni oti na veimaliwai; Na kena isau oqo e salavata kei na vakasama ni veisau ni veiyacovi ni 20E e sega ni vakavuna na gauna ni refractory ni veiwatini, ka vakaraitaka tale na 3D20E me vaka e dua na ka levu ena kena vakadeitaki na veimaliwai ni itubutubu kei na gone. na ivakarau ni vakasucu-yaloka keitou raica ni oti na vakanomodi ni EPP vakatikina e baleta na kena tiko na cakacaka ni 3D20E e se vakatuburi tikoga mai na veika vakayalewa e vakavuna na Mating.
(a, b) 3D20E vakacakacakataki vakakemikali mai na 20E (a) kei na saumaki mai cecere sara / cakacaka (itukutuku e vakaraitaki me vaka na kena ibalebale ± sem mai na tolu na veivakabulabulataki tudei) (b). 0,02; 0,21 μg, P <0,0001; vakatovotovo dodonu ni Fisher, rua na yasana) kei na 10% etanol (0,63 μg, P <0,0001; 0,21 μg, P <0,0001 duadua ga; na kaukauwa cecere (0.63 μg, p = 0.0002; 0.21 μg, p = 0.54; vakatovotovo dodonu nei Fisher, 2-yasana). 0.13 μg, P = 0.0003; vakatovotovo dodonu ni dauqoli, rua na yasana), ni 20E vakatauvatani kei na kena lewa Ena veivakatovotovo cecere duadua ga (0.21 μg, P = 0.022; 0.13 μg, P = 0.0823 ni vakatovotovo cecere, rua-yasana2d). na iwiliwili ni vakasucu mai na 20E ena kena ivakarau cecere (0.21 μg, P = 0.0019; 0.13 μg, P = 0.075; Na veivakatovolei dodonu nei Fisher, rua na yasana). ***P <0,001, ****P <0,001.Na itukutuku e mai na tolu na vakatovotovo.
Ena vakadidike sa oti, keitou sa vakadeitaka ni veisau ni veiyacovi ni steroid hormones e vakavuna na vakaraitaki ni MISO (Mating-vakavuna na veivakauqeti ni Oogenesis 11), e dua na gene ni vakasucu yalewa ka taqomaki A. keitou sa qai vakatulewataka me keitou kila se cava na homoni 3D20E se 20E e vakavuna na kena vakaraitaki na gene oqo. Vg14, 15, 16, MISO a kaukauwa cake sara a vakavuna na 3D20E (itukutuku vakabalavutaki Fig. 3).O koya gona, na veisau ni veiyacovi ni homoni ni steroid androgenic oqo ​​e vaka me vakavuna na iwalewale e taqomaki ira na marama mai na isau e vakavuna na mate ni parasitic. E ciqomi EcR, vakavuna na EcR-A ka vakamalumalumutaka na EcR-B, ka kaukauwa cake na kena vakavuna eso tale na genes ni veiwatini-vakavuna, oka kina na HPX15, ka tara na vakaluveni ni yalewa. e vinaka cake me vakayagataki ena rua na homoni ni ecdysone ka rawa ni vakavuna na cakacaka ni veiyacovi.
Tarava, keitou vakatovolea na cakacaka ni rua na genes ni EcK e laurai ena noda paipo ni bioinformatics. 2b, c kei na ikuri ni teveli 2), keitou vakadeitaka na kena cakacaka ni ecdysteroid kinase ena kena vakatuburi vata kei na 20E, ka vakavuna na phosphorylation 20E22P (itukutuku vakabalavutaki itaba 2). 4c), e vakaraitaka ni 20E ka sega ni 3D20E e rawa ni takete vinaka duadua ni EcK2.
Me vaka na neitou vakadidike ni RNA-seq, EcK2 a vakaraitaki talega vakalevu ena LRT ni goneyalewa goneyalewa, na vanua e a bokoci kina ni oti na veiwatini (Fig. 2b).Keimami vakadeitaka na itukutuku oqo ka vakadeitaka ni EcK2 vakaraitaka e sega ni vakaleqai ena dra ni vakani (Itukutuku vakabalavutaki Fig. 5a).Vakabalavutaka na noda peitiak ni . 20E22P a veivolekati sara kei na cecere ni 20E (22-26 na auwa ni oti na kakana ni dra; itukutuku vakabalavutaki Fig. 5b). EcK2 talega phosphorylates 20E ena marama. mai na 30% ni goneyalewa vakalutu yaloka (Itukutuku vakabalavutaki Fig. 5f).Kevaka e vakayacori na veisele vakarua ni Eck2 RNA (dsEcK2) ni oti na vakani dra, e sega ni yaco na vakasucu, ena gauna oqori na 20E cecere ena vuku ni dra ingestion sa lutu sobu na veitokoni ni ivakaraitaki oqo. vakasucu, ia ena gauna ga e bokoci kina na buloko ni vakasucu (EcK2 kei na so tale na ka) ena veimaliwai.E sega ni 20E se 3D20E na veisele e tarova na EcK2 vakaraitaka ena goneyalewa (Itukutuku vakabalavutaki Fig. 5g), e vakaraitaka ni so tale na ka e vakavuna na kena tarovi na kena vakatabui na kena vakatabui na ivakatagedegede ni kinase oqo. e rauta me vakavuna na sega ni vakacegu ni veiwatini, ia era a vakavuna vakavinaka na titers cecere ni veiyacovi 3D20E.
Na noda isau e vakarautaka na vakasama bibi ki na iwalewale ni kena vakalawataki na rawaka ni vakasucu ni A. gambiae. E dua na ivakaraitaki sa basika mai ena vanua era sa tubu kina na tagane me ra bulia na titers cecere ni 3D20E, e dua na tagane-vakatabakidua ecdysone veisautaki ka vakadeitaka na itubutubu ena kena vakalailaitaki talega na yalewa me ra vakawati tale. vakayacora na 3D20E ena marama ena kena saumi na veisau ni veiyacovi ni tagane-vakatabakidua EPP.Me noda kila, oqo na imatai ni ivakaraitaki ni dua na tagane- kei na yalewa-vakatulewataki steroid hormone ivakarau ni vakayacora e dua na cakacaka duatani ka bibi ena manumanu lalai. na vakasama 18 sai koya ni cakacaka oqo e rawa ni vakayacori mai na 20E precursor E1. E kilai levu ni ena Drosophila, monandry e vakavuna na veisau ni veiyacovi ni peptides lalai ni veiyacovi 19,20 ka veimaliwai kei na neurons vakadeitaka na sala ni vakasucu ni yalewa ena kena vakayagataki na sikinala ni veiyacovi sobu. na veivakacacani e lewa na 3D20E ena A. gambiae yalewa ka me vakadeitaka kevaka e rawa ni maroroi na veivakacacani oqo ena maliwa ni namu kei na Drosophila.
Ni soli na itavi bibi ni 3D20E ena vakaluveni vakayalewa kei na itovo e laurai ena noda vuli, na salatu e liutaka na 3D20E synthesis kei na vakabulabulataki e solia na madigi vou me baleta na iwalewale ni kena lewai na namu ena veisiga ni mataka, me vaka na itabatamata ni veisisivi tagane vakaluveni imita vakaluveni wild iwalewale ni U3. Na cakacaka ni tagane-vakatabakidua ni 3D20E e rawa ni a yaco ena gauna e rawata kina o A. gambiae kei na so tale na mataqali Cellia na kena rawa ni coagulate na nodra wai ni tagane ki na plugs ni veiwatini, me vaka ni oqo e rawa kina na kena vakadewataki vakavinaka na iwiliwili levu ni homoni kei na enzymes ni monary. (ena kena vakaraitaki vakalevu na MISO) me vinakati kina na nodra bulabula ni vakaluveni ena vanua e levu kina na malaria, ka vakavuna vakadodonu na kena vakadewataki na Plasmodium. oqo na veitiki bibi ni veimaliwai ni namu-parasite.
A. gambiae G3 veimataqali era susugi ena ruku ni ituvaki ni manumanu lalai (26-28 °C, 65-80% na ivakarau ni katakata, 12:12 h rarama/butobuto photoperiod). na namu era a vakani ad libitum 10% na iwali ni dextrose kei na dra ni tamata ena veimacawa (vakadidike na veitiki ni dra).E rawati na namu goneyalewa ena kena wasei na veiwatini ena gauna ni pupal ni oti na kena dikevi na kena itinitini ena misini ni vakadidike.Na tagane era kauta tiko na DsRed transgene sa vakamacalataki oti.
Na veivakatovolei ni veiwatini vakasaurarataki e vakayacori me vaka na veivakadonui sa vakamacalataki oti. Me baleta na veiwatini vakayago, era maroroi na yalewa goneyalewa yabaki 4 ena dua na 1:3 na ratio vata kei ira na tagane goneyalewa matua vakaveiwatini me rua na bogi. vakalevu duadua na vakanomodi (Itukutuku Vakabalavutaki Fig. 2b).
Na yago ni namu, vo ni yago mate (vo ni yago), se yago taucoko era a vakacacani ki na 100% na methanol ka vakatautauvatataki ena dua na beader (2 mm na bilo bilo, 2,400 rpm, 90 na sekodi). MAG, 50-100 80 na ml; LRT yalewa, 25-50 80 μl.Na precipitate a vakayacori ki na dua na ikarua ni methanol vakasavasavataki vata kei na iwiliwili vata ga ni methanol.Na benu ni sela a kau laivi ena centrifugation. 50 na ml; MAGs kei na LRT yalewa, 30 μl.
Na ivakaraitaki era a vakadikevi ena dua na spectrometer ni levu (ID-X, Dauqoli ni katakata) cokovata kei na dua na iyaya ni cakacaka ni LC (Vanquish, Dauqoli ni katakata). (wai, 0.1% asidi ni fomiki) kei na B (asidi ni fomi, 0.1% asidi ni fomi).Na LC gradient e vakaoqo: 5% B me baleta na 1 na miniti, qai vakalevutaki ki na 100% B ena 11 na miniti.Ni oti na 8 na miniti ena 100%, vakatautauvatataka tale na duru ena3. ml min-1.Ionization ena ivurevure ni MS e vakayacori ena kena vakayagataki na ionization ni livaliva ena ivakarau vinaka kei na ca.
Na spectrometer levu e vakarautaka na itukutuku ena m / z mai na 350 ki na 680 ena 60,000 vakatulewa ena ivakarau ni MS taucoko. me baleta na kena sega ni dua na ivakatagedegede e tiko.Me kilai na ecdysteroids sega ni taketetaki, itukutuku ni MS / MS me baleta na veiulu-ni-vanua kece ni HPLC kei na> 15% na levu ni veiwekani era a vakadikevi. tagane.Me baleta na 3D20E, a vakayacori na kena vakarautaki ena kena vakayagataki na iwiliwili ni veika oqo: [M + TFA] -, [M + COOH]-, [M + Na] +, [M + Cl]-, [M + NO3]-. spectra ni E, 20E kei na 3D20E era vakatauvatani ki na veimataqali ivakatagedegede.3D20E22P a vakadikevi ena kena vakayagataki na Girard ni reagent.
3D20E22P a vakasavasavataki mai na MAG.A vakayacori na vakasavasavataki ena dua na ivakarau ni vakadidike ena kena vakayagataki e dua na chromatograph ni wai ni ultra-cakacaka (Rawata, Wai) kei na dua na dauvakadidike ni quadrupole levu-yavutaki (QDa, Rawata, Wai) ena ruku ni ituvaki vata ga ni LC me vaka na vakadidike ni HPLC-MS/MS. 3D20E22P a kunei ena gauna vata ga ni maroroi me vaka e sa vakadeitaki oti.Na savasava ni veivakaduavatataki e lavetaki sa qai dikevi ena HPLC-MS/MS me vaka e vakamacalataki e cake.
Na RNA taucoko a lavetaki mai na 10-12 na yago ni vakasucu se so tale na tiki ni yago (sega ni ulu) ena kena vakayagataki na TRI reagent (Dauqoli katakata) muria na veidusimaki ni dauteitei. na veidusimaki ni dau buli iyaya. va na vakatovotovotaki ni bula era a vakawaicalataka vakava ena wai me baleta na RT-qPCR. kei na itukutuku era a kumuni ka vakadikevi ena kena vakayagataki na ituvatuva kei na vakadidike (ivakadewa 2.4.3).Me vaka e vakaraitaki ena vakadidike oqo, na ilavo ni veiwekani e vakatautauvatataki ki na ribosomal gene RpL19 (AGAP004422), na kena ivakaraitaki e sega ni veisau vakalevu ena dra ni vakani 27 se veimaliwai 3 .
Na ivakarau ni RNA a dikevi ena kena vakayagataki e dua na dauvakadidike ni bula ni Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Na iwiliwili ni wiliwili mapetaki ki na genes a wiliki ena kena vakayagataki na htseq-wiliwili (ivakarau 0.9.1) kei na ivakarau ni ivakarau. 1.28.1) ena R (ivakadewa 4.0.3).
Ecdysone-veisautaka na veidigitaki ni gene era a kilai ena imatai ni vakasaqaqara ena A. gambiae genome ena kena vakayagataki na PSI-BLAST algorithm ( 1, XP_005175332.1 y XP_011294434.1) y demolitor de microplitis (Naba ni icurucuru XP_0685 kei na EcK mai B. mori (Naba ni icurucuru NP_001036900), Drosophila melanogaster (Naba ni icurucuru NP_651202), Apis mellifera (Naba ni icurucuru XP_394838) kei na Acyrthosip (Naba ni icurucuru). XP_001947166); kei na EPP mai na B. mori (Naba ni icurucuru NP_001947166) NP_001177919.1 kei na NP_001243996.1) kei na EO ni D. veitikitiki/kilobase exons ena dua na milioni na mapetaki ni wiliwili (FPKM) se> 85%) ena yago ni vakasucu (LRT yalewa se MAG) e Gambia (ikalawa 2 ). Me vakavinakataki na kena matailalai, keitou digitaka na enzymes ni veidigitaki ka ra vakaraitaki talega ena yago ni vakasucu ni A. albimanus, e dua na mataqali anopheles ka sega ni vakatubura se vakadewataka na ecdysone ena gauna ni veiwatini. iotioti ni filita (ikalawa 4), na genes ni veidigitaki e gadrevi me vakaceguya e lailai duadua e dua vei ira na ka oqo: (1) vakalevu cake-vakalawataki ni oti na veiwatini (P <0.05) me vaka na vakadidike ni duidui ni vakaraitaki ni genes kei na (2) ena sega ni vakaluveni na yago (< 85 % se <100 FPKM).
Eda veisautaka na iwalewale sa vakamacalataki oti 28,29,30 me rawati kina na ivakatakilakila ni isotopic taucoko ni veika bula. 1.7% amino asidi-galala kei na amoniumi sulfate. Na ivurevure duadua ga ni nitrogen. ikava ni instar mate.O ira ga na yalewa era qai vakayagataki ena veivakatovolei ni veiwatini kei na tagane sega ni vakatakilakilataki me ra vakadikeva na proteome tagane e vakadewataki ena gauna ni veiwatini.
4-6 siga na yabaki 15N-vakatakilakilataki na yalewa goneyalewa era a vakasaurarataki me ra veiwatini kei na yabaki-veiganiti sega ni vakatakilakilataki na tagane goneyalewa.Na veiwatini rawaka e vakadeitaki ena kena kunei na veiwatini plugs ena ruku ni epifluorescence microscopy. 186001860, Wai) ena 50 mM amonium bicarbonate kei na ivakaraitaki. vakau ena bogi ki na vale ni vakadidike ni MacCoss ena Univesiti mai Washington, na vanua e vakacavari kina na vakavakarau ni ivakaraitaki me baleta na LC-MS / MS. mM dithiothreitol (DTT; Sigma), alkylated con 15 mM iodoacetamide (Sigma) y incubado en 37 ° C (1: 0 50) para 1 hora con trypsinization: trypsin: substrate ratio). 14,000 rpm me baleta na 10 na miniti ena 4 ° C me kau laivi na benu.Na ivakaraitaki era a savati ena rua na ivakarau ni kaukauwa-iwasewase ni vakasukasuka (Oasis MCX katoni, Wai) ka vakavoutaki tale ena 0.1% na asidi ni fomiki me baleta e dua na iotioti ni protein vakasama ni 0.33 μg-μGU. vakatautauvatataki mai na tagane goneyalewa.E rua na vakatovotovotaki ni vakatovotovotaki e vakatovotovotaki me baleta na ivakaraitaki yadua.Tarava, 1 μg ni dua e vakadikevi ena kena vakayagataki e dua na 25-cm vakavotukanataki tale na silika 75-μm na duru kei na dua na 4-cm na silika vakavotukanataki Kasil1 (PQ) frit trap C-2. (Vakasaqaqara) kei na 180 na miniti ni wai ni vakasaqa. Na ivakaraitaki ni digests - MS / MS a cici ena dua na Q-vakadodonu HF levu spectrometer (Thermo dauqoli) vata kei na dua na nanoACQUITY UPLC ivakarau (Wai). FASTA itukutuku e tiko kina na veitarataravi ni protein mai na Anopheles gambiae (VectorBase vakadewa 54), Anopheles coluzzi A vakayacori e dua na vakasaqaqara ena Mali-NIH (VectorBase vakadewa 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Maji 2021), A. Na veivakadukadukalitaki. ena veicici yadua me vaka sa vakamacalataki oti.NSAF veiwekani ki na veitiki yadua ni protein a vakatautauvatataki ena ivakaraitaki mai na rua na duidui ni veivakatautauvatataki ni bula. cici vakatekinoloji, na vanua e cici kina na ivakaraitaki raw ni oti na ivakaraitaki ni tagane/veiwatini, me vaka na vua ni HPLC “kauta cake”.Eso na gauna na proteins e kunei me vaka na ‘vakadukadukalitaki’ mai na goneyalewa vakatakilakilataki era sa volai tu ena ikuri ni Teveli 1.
E rua na peptides antigenic, QTTDRVAPAPDQQQ (ena loma ni isotype PA) kei na MESDGTTPSGDSEQ (ena loma ni isotype PA kei na PB) ena Genscript. ena veivakasavasavataki ni veiwekani.IgG mai na rapiti EPP-vakatabakidua duadua e vakayagataki me baleta na kena tomani tale na tokalau ni blotting.
Me baleta na blots ni tokalau, MAG (n = 10, na vanua e vakaraitaka kina n na iwiliwili ni ivakaraitaki ni namu tu vakataki koya) kei na LRT yalewa (n = 30) mai na tagane goneyalewa yabaki 4 kei na goneyalewa se vakasaurarataki-veiwatini (<10 ni oti na veiwatini), Buffer ni kena kau laivi na protein (50 m. 0.25% na sodium deoxycolate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 × veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki (Roche)) a vakacurumi vakatikitiki. Oti, 20 μg ni MAG protein, 40 μg ni LRT protein, kei na 20 μg ni vo ni protein levu era a vakacacani ka wasei ki na MOPST 10% BiPro- × PBS-T (0.1% Tween-20 ena PBS) ka qai vakatabui ena Odyssey ni tarova na buffer (Li-Cor) me baleta na 1 na auwa ena 22°C. 1: 4,000). 1:20,000) ena kena tarovi na buffer e tiko kina na 0.01% SDS kei na 0.2% Tween -20 me baleta na 1 na auwa ena 22 °C. kDa) e sega ni laurai.
Na vanua ni coding ni EPP (me vaka na isoform AGAP002463-RB e tiko kina na vanua ni histidine phosphatase, NCBI maroroi na vanua ni vakasaqaqara 34) kei na EcK2 (AGAP002181) era a cloned ki na pET-21a (+) plasmid (Novagen Millipore Sigma) ; primers era sa volai tu ena Teveli ni itukutuku vakabalavutaki 2. E walu na GS4 veitaratara (ena tandem) era a vakacurumi ni bera na C-iotioti 6xNona ivakatakilakila ni pET-21a (+) -EcK2 tara. Na NEBEexpress Ni spin duru (Niu Igiladi BioLabs).Dihydrofolate reductase (DHFR) lewa protein a caka ena kena vakayagataki na ivakaraitaki ni DNA mai na NEBExpress sela-galala E. coli protein synthesis Kit.
Na cakacaka ni phosphatase ni EPP kei na veitiki ni yago a vakarautaki ena kena vakayagataki na 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich). homogenized ena isau ni buffer kei na benu ni sela a kau laivi ena centrifugation. Tekivutaka na isau ena kena vakacurumi na enzyme se na yago lavetaki ki na isau ni buffer e tiko kina na 2.5 mg ml-1 pNPP. 405 nm ena veigauna duidui.
Me baleta na cakacaka ni EcK ena vitro, na protein a vakasucumi vata kei na 0.2 mg 20E se 3D20E ena 200 μl buffer (pH 7.5) e tiko kina na 10 mM HEPES-NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ad ATP kei na 10 mM Mg2d ena 2 h. 800 μl methanol, qai vakamamacataki ena -20 ° C me baleta na 1 na auwa, qai centrifuged ena 20,000 g me baleta na 10 na miniti ena 4 ° C. min ena 95°C.
Me baleta na itaviqaravi ni EPP ena vitro, na protein a vakasucumi vata kei na 3D20E22P (tautauvata kei na levu e kune ena 18 na veiwatini ni MAG, vakasavasavataki mai na HPLC-MS / MS) ena 100 μl buffer (pH 7.5) e tiko kina na 25 mM Tris, 50 mM Bi2M asidi m50. Nacl, 0.1 mM EDTA, kei na 1 mM DTT me baleta na 3 na auwa ena 27 °C.Na kena isau e a tarovi ena kena vakacurumi na 400 μl ni methanol ka vakamamacataki ena -20 °C me baleta na 1 na auwa, qai vakasavasavataki ena 20,000 g me baleta na 10 na miniti ena 4°C.
Na tikitiki ni PCR me baleta na EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) kei na EcK2 (556 bp) era a vakalevutaki mai na cDNA vakarautaki mai na veiwaki-veiwatini ulu ni namu cadavers. pCR2.1-eGFP; Na PCR primers era sa volai tu ena Teveli ni itukutuku vakabalavutaki 2. Na tiki ni PCR a vakacurumi ena maliwa ni veivakatorocaketaki ni T7 veisautaki ena pL4440 plasmid. ki na T7 promoter (Teveli ni itukutuku vakabalavutaki 2) era a vakayagataki me ra vakalevutaka na vakacurumi mai na pL4440-yavutaki plasmid. vakamacalataki.
Me baleta na dsRNA ni veisele, 1,380 ng ni dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) a vakacurumi ena dua na vakasama ni 10 ng nl-1 ki na thorax ni tagane se yalewa qase (Nanoject III, Drummond) ena loma ni 1 na siga ni oti na ivakatagedegede ni biological ena RNA lavelavetaki, cDNA synthesis, kei na RT-qPCR. vakatautauvata, vakatau ena ituvatuva ni veivakatovolei se 6.3 ng nl-1.Vakacuruma na 100 nl ni 10% (iwiliwili/iwiliwili) etanol ena wai; 100 nl ni 3D20E22P ena 10% ni etanoli (tautauvata kei na 75% ni levu e kune ena dua na veiwatini ni MAGs).Era a lesi vakaveitalia na namu ki na ilawalawa ni veivakabulabulataki.
Me baleta na veivakatovolei ni vakasucu, era a vakani na yalewa yabaki 3 ad libitum ena dra ni tamata.Kauta laivi na namu vakatikina se sega ni vakani.Me vakatau ena veiqaravi, era biu na yalewa ena bilo ni vakasucu duidui me va na bogi ke lailai ni 48 na auwa ni oti na kakana ni dra. vei ira na yalewa era sa veiwatini, na yaloka era sucu me ra larvae era okati me ra vakaluveni.
Me baleta na veivakatovolei ni veiwatini, era a vakatarai na yalewa me lailai duadua na 2 na siga me vakatau ena veiqaravi me ra vakatorocaketaka na veitusaqati ki na veiwatini, kei na tagane ni manumanu kila-mataqali yabaki-veiganiti era a qai vakacurumi ki na dua ga na vale ni manumanu. mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, kei na 25 mM NaCl (pH 8.2). na kena kunei na veitarataravi ni Y; primers era sa volai tu ena Teveli ni itukutuku vakabalavutaki 2.Na sega ni tiko ni Y na veitarataravi ni chromosome e vakaraitaka ni sega ni dua na veiwatini.
Me baleta na veivakatovolei ni veimaliwai tale, era a vakadikevi na marama vakasaurarataki me baleta na kena tiko na plugs ni veimaliwai me vakadeitaka na ituvaki ni veimaliwai ka vakatara e 2 na siga me vakatorocaketaka na refractoriness ki na veimaliwai ena kena sega na tagane, me vaka e vakamacalataki taumada 36 . vesicles era a vakacacani mai na marama, kei na DNA ni genomic a vakarautaki me vaka e vakamacalataki e cake ka vakayacori ki na qPCR ni vakadidike ni DsRed transgene; na veivakadeitaki era sa volai tu ena Teveli ni itukutuku vakabalavutaki 2.Na sega ni tiko ni DsRed transgene e vakaraitaka ni sega ni dua na veimaliwai tale e yaco.
3D20E a vakavotukanataki tale me vaka sa vakamacalataki oti 37 .Vakalekaleka, 10 mg ni 20E (Sigma-Aldrich) a vakawabokotaki ena 10 ml ni wai, ka tarava mai na ikuri ni 30 mg ni palatini karakarawa (ena fomu ni pauta, Sigma-Aldrich). vakauqeti ena ivakarau ni katakata ni rumu.Ni oti na 6 na auwa, 30 mL ni methanol a vakuri me tarova na kena isau.Na veiwaki a centrifuged me kau laivi na veitiki ni catalyst.Na supernatant a vakawaicalataki ki na mamaca ena vacuo ena ivakarau ni katakata ni rumu. vakadidike.Na iwiliwili ni saumaki mai (mai na 20E ki na 3D20E) e rauta ni 97% (iVakaraitaki 4b), kei na MS ni 3D20E vakarautaki e veiganiti kei na kena e kune ena marama vakawati (iVakaraitaki 4c).
Na italanoa e tiko kina na itukutuku matailalai ni veivakatovolei ni iwiliwili e vakayacori.GraphPad (ivakadewa 9.0) a vakayagataki me vakayacori kina na veivakatovolei dodonu ni Fisher, veivakatovolei ni Mantel-Cox, kei na veivakatovolei ni gonevuli. Na veisoliyaki ni itukutuku e vakatovolei me baleta na kena ivakarau ena kena vakayagataki na Shapiro-Wilk vakatovotovo kei na dua na icurucuru bibi ni 0.05.Ni sega ni rawata na itukutuku na vakatovotovo ni kena ivakarau, a vakayacori na veivakatovolei ni Mann-Whitney. 1.28.1) a vakayagataki me vakayacori kina na RNA-seq gene-ivakatagedegede ni duidui ni vakamacala ni vakadidike.Na barausa vakababa ena kalavo e vakaraitaka na median.E dua na bibi ni P = 0.05 a vakayagataki me vaka na icurucuru me baleta na veivakatovolei kece sara.
Me baleta na ikuri ni itukutuku me baleta na ituvatuva ni vuli, raica na Ripote ni Vakadidike ni Veika Bula abstract e semati ki na itukutuku oqo.
Na itukutuku ni MS proteomic era a biu ki na ProteomeVeisau ni Veisau ni Veisau ni Veisau (Http.
Na itukutuku ni RNA-seq e biu tu ena Vale ni Volavola Raraba ni Gene Vakamacalataki ena ruku ni itukutuku ni veitarataravi ni GSE198665.
Na ikuri ni datasets vakatuburi kei na/se vakadikevi ena gauna ni vuli ena gauna oqo e rawa ni rawati mai vei ira na dauvolavola veiganiti ena kerekere veiganiti.Na itukutuku oqo e vakarautaka na itukutuku ni ivurevure.
De Loof, A. Na manumanu lalai: Na manumanu lalai ni veiyacovi ni manumanu lalai?Tagane: Kato karakarawa.Saenisi ni manumanu lalai.13, 325-338 (2006).
Damudamu, CPF 20-hidroksiekdisoni kei na veivakatorocaketaki ni ovari ena Anopheles stephens.J. 28, 97-109 (1982).