Na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki e dua na ka bibi ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki (TME), ia ena vica na vakavotukana, na nodra ivakatakilakila e se sega tikoga ni kilai vakalevu. Eke, keitou vakadikeva na vuvuce kei na T na sela mai na vuvuce kei na ascites ni tauvimate kei na kalasi cecere ni serous ni kenisa (HGSC) me vakaraitaka na metabolome ni veitiki ni TME duidui oqo. Na ascites kei na sela ni vuvuce e tiko kina na duidui levu ni veisau. Ni vakatauvatani kei na ascites, na sela ni T e vakacuruma na vuvuce e vakavutuniyautaki vakalevu ena 1-metilikotinamide (MNA). E dina ga ni sa cecere na ivakatagedegede ni MNA ena T sela, na vakaraitaki ni nicotinamide N-methyltransferase (e dua na enzyme e catalyzes na veisau ni ilawalawa ni methyl mai na S-adenosylmethionine ki na nicotinamide) e vakaiyalayala ga ki na fibroblasts kei na sela ni vuvuce. Ena cakacaka, na MNA e vakavuna na sela ni T me ra vakabulabulataka na vuvuce-vakatorocaketaka na vuvuce ni vuvuce ni alpha. O koya gona, TME-vakadewataki MNA e cau ki na lawatu ni itataqomaki ni T na sela ka matataka e dua na takete ni immunotherapy rawa me baleta na kena qaravi na kenisa ni tamata.
Na metabolites ni vuvuce e rawa ni dua na kena revurevu titobu ni veivakatabui ena itataqomaki ni vuvuce, ka levu cake na ivakadinadina e vakaraitaka ni rawa talega ni ra veiqaravi me vaka e dua na kaukauwa bibi ni draiva me baleta na toso ni mate (1). Me ikuri ni kena revurevu ni Warburg, sa tekivu na cakacaka se qai oti ga oqo me vakatakilakilataka na ituvaki ni metabolic ni sela ni vuvuce kei na kena veiwekani kei na ituvaki ni itataqomaki ni vuvuce ni vuvuce (TME). Na vakadidike ena ivakaraitaki ni kalavo kei na tamata T na sela e vakaraitaka ni glutamine na veisau (2), na veisau ni oxidative (3) kei na veisau ni suka (4) e rawa ni cakacaka vakataki koya ena veimataqali ilawalawa lalai ni sela ni itataqomaki. E vica na metabolites ena sala oqo e tarova na cakacaka ni veivakabulabulataki ni T na sela. Sa vakadinadinataki ni kena tarovi na coenzyme ni tetrahydrobiopterin (BH4) e rawa ni vakacacana na kena vakalevutaki na sela ni T, kei na kena vakalevutaki na BH4 ena yago e rawa ni vakatorocaketaka na isau ni itataqomaki ni yago e vakavuna na CD4 kei na CD8. Me kena ikuri, na kena revurevu ni veivakabulabulataki ni kynurenine e rawa ni vakabulai ena kena vakayagataki na BH4 (5). Ena isocitrate ni veivakabulabulataki (IDH) glioblastoma, na veivakabulabulataki ni enantiometabolic (R) -2-hydroxyglutarate (R-2-HG) e tarova na veivakabulabulataki ni sela ni T, vakalevutaki kei na cakacaka ni cytolysis (6). Ena dua na gauna lekaleka sa oti, sa vakaraitaki ni methylglyoxal, e dua na ka e rawati mai na glycolysis, e vakavuna na sela ni veivakabulabulataki ni myeloid itekitekivu, kei na T sela ni veisau ni methylglyoxal e rawa ni tarova na cakacaka ni sela ni T. Ena veiqaravi, na vakacacani ni methylglyoxal e rawa ni vakadruka na cakacaka ni myeloid-vakadewataki na sela ni veivakacacani (MDSC) ka vakalevutaka na veiqaravi ni veivakacacani ni veivakacacani ena ivakaraitaki ni kalavo (7). Na vakadidike oqo e vakabibitaka vata na itavi bibi ni TME-vakadewataki na metabolites ena kena vakalawataki na cakacaka ni T sela kei na itaviqaravi.
Na vakacacani ni sela ni T sa ripotetaki vakalevu ena kenisa ni ovarian (8). Oqo e baleta vakalailai na ivakarau ni metabolic e tiko ena hypoxia kei na veivakacacani ni veivakacacani (9), ka vakavuna na kena saumaki mai na suka kei na tryptophan ki na veika e vakayagataki me vaka na asidi ni lactic kei na kynurenine. Na lactate sivia e vakalailaitaka na kena buli na veivakacacani-γ (IFN-γ) ka vakavuna na duidui ni ilawalawa lalai ni veivakacacani (10, 11). Na vakayagataki ni tryptophan e vakataotaka vakadodonu na tubu ni sela ni T ka vakataotaka na vakatakilakila ni T ni sela (12-14). Dina ga ni raica oqo, e vuqa na cakacaka wavolita na itataqomaki ni yago a vakayacori ena vitro T sela itovo vakavanua ena kena vakayagataki na itukutuku vakavinakataki, se vakaiyalayala ki na ivakaraitaki ni kalavo homologous ena vivo, e sega ni dua vei rau e vakaraitaka taucoko na heterogeneity ni kenisa ni tamata kei na ituvaki ni macro kei na micro ni yago.
E dua na ka e dau yaco ena kenisa ni yatevuso oya na kena tete ena kete kei na kena laurai na ascites. Na kena kumuni na wai ni sela ena ascites e salavata kei na mate toso ki liu kei na dravudravua ni kena vakaraitaki (15). Me vaka na itukutuku, na tabana duatani oqo e hypoxic, e tiko kina na ivakatagedegede cecere ni tubu ni vascular (VEGF) kei na indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), ka sa vakacurumi mai na T vakalawataki na sela kei na myeloid vakatabui na sela (15-18). Na vanua ni metabolic ni ascites e rawa ni duidui mai na kena ni vuvuce, sa sega kina ni matata na kena vakavoutaki na sela ni T ena vanua ni peritoneal. Me kena ikuri, na duidui bibi kei na heterogeneity ena maliwa ni ascites kei na metabolites e tiko ena vanua ni vuvuce e rawa ni vakataotaka na kena curu mai na sela ni itataqomaki kei na nodra cakacaka ena vuvuce, ka gadrevi eso tale na vakadidike.
Me rawa ni wali na leqa oqo, keitou a tuvanaka e dua na veibiu ni sela vakaloloma kei na wai chromatography tandem lewe levu spectrometry (LC-MS / MS) iwalewale me vulici kina na veimataqali sela duidui (oka kina na CD4 + kei na CD8 + T sela) vakakina ena loma kei na maliwa ni tumors Na kena metabolites span na sela ena dua ga na ascites kei na vanua ni tauvimate ni tauvimate. Eda vakayagataka na iwalewale oqo ena kena vakayagataki vata kei na cytometry ni drodro cecere kei na dua ga na sela ni RNA ni veitarataravi (scRNA-seq) me vakarautaka e dua na iyaloyalo cecere ni vakatulewa ni ituvaki ni metabolic ni iwiliwili bibi oqo. Na iwalewale oqo e vakaraitaka e dua na tubu levu ena ivakatagedegede ni 1-methylnicotinamide (MNA) ena sela ni T ni vuvuce, kei na veivakatovolei ena vitro e vakaraitaka ni sega ni kilai taumada na kena revurevu ni MNA ena cakacaka ni sela ni T. Ena kena levu, na iwalewale oqo e vakaraitaka na veimaliwai ni metabolic veimaliwai ena maliwa ni tumors kei na sela ni itataqomaki, ka vakarautaka na vakasama duatani ki na metabolites ni lawatu ni itataqomaki, ka rawa ni yaga me baleta na veiqaravi ni T sela-yavutaki na kenisa ni ovarian immunotherapy Na madigi ni veiqaravi.
Eda vakayagataka na cytometry ni drodro cecere me vakarautaki ena dua ga na gauna na kena vakayagataki na suka [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl) amino) -2-deoxyglucose (2-NBDG) kei na itaviqaravi ni mitochondrial [MitoTracker titobu Damudamu, DR1) ivakarau ni ivakatakilakila e vakaduiduitaka na sela ni itataqomaki kei na iwiliwili ni sela ni tumor (Teveli S2 kei na itaba S1A). Na vakadidike oqo e vakaraitaka ni vakatauvatani kei na T na sela, ascites kei na sela ni vuvuce e cecere cake na ivakatagedegede ni suka, ia e lailai na duidui ena cakacaka ni mitochondrial. Na ivakatautauvata ni suka e tauri mai na sela ni vuvuce [CD45-EpCAM (EpCAM) +] e tolu ki na va na gauna mai na sela ni T, kei na ivakatautauvata ni suka e tauri mai na CD4 + T na sela e 1.2 na gauna mai na CD8 + T na sela, ka vakaraitaka ni tumo infiltrating lymphocytes ena TME e gadrevi kina na T1 e duidui). Ena kena veibasai, na cakacaka ni mitochondria ena sela ni tumor e tautauvata kei na CD4 + T na sela, kei na cakacaka ni mitochondria ni rua na mataqali sela e cecere cake mai na CD8 + T na sela (iTaba 1B). Ena kena levu, na veika oqo e vakaraitaka na ivakatagedegede ni metabolic. Na cakacaka ni metabolic ni sela ni tumor e cecere cake mai na CD4 + T na sela, kei na cakacaka ni metabolic ni CD4 + T na sela e cecere cake mai na CD8 + T na sela. Dina ga ni veika oqo ena veimataqali sela, e sega ni dua na duidui tudei ena ituvaki ni metabolic ni CD4 + kei na CD8 + T se na nodra veiwekani ena ascites ni vakatauvatani kei na vuvuce (iTaba 1C). Ena kena veibasai, ena iwasewase ni CD45-sela, na iwiliwili ni EpCAM + sela ena vuvuce e tubu ni vakatauvatani kei na ascites (iTaba 1D). Keitou raica talega e dua na duidui matata ni metabolic ena maliwa ni EpCAM + kei na EpCAM- veitiki ni sela. EpCAM + (tumor) na sela e cecere cake na kena tauri na suka kei na cakacaka ni mitochondrial mai na EpCAM- na sela, ka sa cecere sara mai na cakacaka ni metabolic ni fibroblasts ena sela ni tumo ena TME (iTaba 1, E kei na F).
(A kei na B) Na kaukauwa ni fluorescence ni veimama (MFI) ni suka ni suka (2-NBDG) (A) kei na itaviqaravi ni mitochondrial ni CD4 + T na sela (MitoTracker damudamu butobuto) (B) Na kalavo ni mata (imawi) kei na itukutuku vakarautaki (dodonu), CD8 + T na sela kei na EpCAM + T na sela mai na CD45-. (C) Na ivakarau ni CD4 + kei na CD8 + na sela (ni CD3 + T na sela) ena ascites kei na vuvuce. (D) Na iwiliwili ni EpCAM + na sela ni vuvuce ena vuvuce kei na vuvuce (CD45-). (E kei na F) EpCAM + CD45-tumo kei na EpCAM-CD45-vakatuburi ni suka (2-NBDG) (E) kei na cakacaka ni mitochondrial (MitoTracker damudamu butobuto) (F) kalavo ni mata (imawi) kei na itukutuku tabulated ( Matau) Ascites kei na sela ni vuvuce. (G) Na kalavo ni mata ni CD25, CD137 kei na PD1 vakaraitaka ena drodro ni veisele. (H kei na au) CD25, CD137 kei na PD1 vakaraitaka ena CD4 + T na sela (H) kei na CD8 + T na sela (au). (J kei na K) Naive, vakanananu ni lomadonu (Tcm), vakanananu ni vakanananu (Teff) kei na vakanananu ni vakanananu (Tem) na veivakasama e yavutaki ena vakaraitaki ni CCR7 kei na CD45RO. Na iyaloyalo ni mata (imawi) kei na itukutuku ni tabu (dodonu) ni CD4 + T na sela (J) kei na CD8 + T na sela (K) ena ascites kei na vuvuce. P na isau e vakadeitaki ena veiwatini t-vakatovolei (* P <0.05, ** P <0.01 kei na *** P <0.001). Na laini e vakaraitaka na tauvimate veiganiti (n = 6). FMO, na lumilumisa ni dua; MFI, na kaukauwa ni cina ni veimama.
Na vakadidike tale eso e vakaraitaka eso tale na duidui bibi ena maliwa ni ituvaki ni T sela phenotypic cecere ni vakatulewataki. Na vakacakacakataki (itaba 1, G ki na au) kei na vakanananu ni effector (itaba 1, J kei na K) ena veivakacacani e levu cake sara mai na ascites (iwiliwili ni CD3 + T na sela). Vakakina, vakadikeva na phenotype ena kena vakaraitaki na ivakatakilakila ni veivakabulabulataki (CD25 kei na CD137) kei na ivakatakilakila ni vakalailaitaki [parokaramutaki ni mate ni sela protein 1 (PD1)] e vakaraitaka ni dina ga ni duidui na ivakarau ni metabolic ni iwiliwili oqo (iTaba S1, B ki na E) , Ia e sega ni dua na duidui bibi ni metabolic subservor ena maliwa ni observ, F ki na I). Na veika oqo e vakadeitaki ena kena vakayagataki na iwalewale ni vuli misini me lesi vakataki koya na phenotypes ni sela (21), ka vakaraitaka tale na kena tiko e dua na iwiliwili levu ni sela ni sui (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ena ascites ni tauvimate (iTaba S2A ). Ena maliwa ni veimataqali sela kece e vakatakilai, na iwiliwili ni sela ni myeloid oqo e vakaraitaka na cecere duadua ni suka kei na cakacaka ni mitochondrial (iTaba S2, B ki na G). Na veika oqo e vakaraitaka na duidui kaukauwa ni metabolic ena maliwa ni veimataqali sela e vuqa e kune ena ascites kei na vuvuce ena HGSC tauvimate.
Na bolebole levu ena kena kilai na itovo ni metabonomic ni TIL sa ikoya na kena gadrevi me vakatikitikitaki na ivakaraitaki ni T sela ni savasava e rauta, vinaka kei na levu mai na tumors. Na vakadidike se qai oti ga oqo e vakaraitaka ni veiwasei kei na iwalewale ni vakavutuniyautaki ni bead e yavutaki ena drodro ni cytometry e rawa ni vakavuna na veisau ena itukutuku ni metabolite ni sela (22-24). Me wali na leqa oqo, keitou vakavinakataka na iwalewale ni vakavutuniyautaki ni bead me vakatikitikitaki ka vakatikitikitaki TIL mai na veisele ni tamata ni ovarian ni bera na vakadidike mai na LC-MS / MS (raica na iyaya kei na iwalewale; itaba 2A). Me rawa ni vakalewai na kena revurevu raraba ni ivakarau oqo ena veisau ni metabolite, keitou vakatauvatana na itukutuku ni metabolite ni T na sela vakacakacakataki mai vei ira na dausoli ka bulabula ni oti na ikalawa ni veibiu ni bead e cake kei na sela era sega ni veibiu ni bead ia era tiko ga ena aisi. Na vakadidike ni lewa vinaka oqo e kunei ni tiko e dua na veiwekani cecere ena maliwa ni rua na ituvaki oqo (r = 0.77), kei na kena vakatovotovotaki vakatekinoloji ni ilawalawa ni 86 metabolites e cecere na kena vakatotolotaki (iTaba 2B). O koya gona, na iwalewale oqo e rawa ni vakayacora na vakadidike dodonu ni metabolite ena sela e sotava tiko na mataqali sela vakavutuniyautaki, vakakina na kena vakarautaki na imatai ni ituvatuva cecere-vakatulewa me baleta na kena kilai na metabolites vakatabakidua ena HGSC, ka rawa kina vei ira na tamata me ra rawata e dua na kila titobu ni sela vakatabakidua Porokaramu ni veiyacovi.
(A) Na iyaloyalo ni ituvatuva ni vakavutuniyautaki ni bead ni makeneta. Ni bera ni vakadikevi ena LC-MS/MS, na sela ena lako curuma e tolu na veitaravi ni veivakatorocaketaki ni bead ni makeneta se tiko ga ena aisi. (B) Na kena revurevu ni mataqali vakavutuniyautaki ena levu ni veisau. Na ivakatautauvata ni tolu na ivakarau me baleta na mataqali vakavutuniyautaki yadua ± SE. Na laini vulavula e vakaraitaka e dua na veimaliwai 1:1. Na veiwekani ni kalasi ni loma (ICC) ni veivakatovolei vakawasoma e vakaraitaki ena ivakatakilakila ni axis. NAD, nikotinamidi adenina dinukleotidi. (C) Na iyaloyalo ni ituvatuva ni cakacaka ni vakadidike ni metabolite ni tauvimate. Na ascites se na vuvuce e dau kumuni mai vei ira na tauvimate ka maroroi ena batabata. E dua na iwase lailai ni ivakaraitaki yadua e vakadikevi ena drodro ni cytometry, ni vo ni ivakaraitaki e vakayacori e tolu na rauni ni vakavutuniyautaki me baleta na CD4 +, CD8 + kei na CD45- na sela. Na veitiki ni sela oqo era a vakadikevi ena kena vakayagataki na LC-MS / MS. (D) Mape ni katakata ni vakatautauvatataki ni levu ni veisau. Na dendrogram e vakaraitaka na ilawalawa ni Ward ni veimama ni Euclidean ena maliwa ni ivakaraitaki. (E) Na vakadidike ni iwasewase levu (PCA) ni ivakaraitaki ni mape ni metabolite, vakaraitaka e tolu na ivakaraitaki ni ivakaraitaki yadua, ivakaraitaki mai na tauvimate vata ga e semati ena dua na laini. (F) Na PCA ni itukutuku ni metabolite ni ivakaraitaki vakarautaki ena tauvimate (oya, vakayagataka na vakatikina ni vakasukai); na mataqali ivakaraitaki e vakaiyalayala na waqavuka convex. PC1, iwasewase levu 1; PC2, iwasewase levu 2.
Tarava, keitou vakayagataka na iwalewale ni vakavutuniyautaki oqo me vakadikevi kina na 99 na veisau ena iwasewase ni CD4 +, CD8 + kei na CD45-sela ena ascites taumada kei na vuvuce ni ono na tauvimate ni HGSC (itaba 2C, itaba S3A kei na teveli S3 kei na S4). Na iwiliwili ni taleitaka e 2% ki na 70% ni ivakaraitaki levu taumada ni sela bula, kei na iwiliwili ni sela e duidui sara vakalevu ena kedra maliwa na tauvimate. Ni oti na kena wasei na beads, na iwasewase vakavutuniyautaki ni taleitaki (CD4 +, CD8 + se CD45-) e sivia na 85% ni sela bula kece ena ivakaraitaki ena ivakatautauvata. Na iwalewale ni vakavutuniyautaki oqo e rawa kina vei keda me da vakadikeva na iwiliwili ni sela mai na metabolism ni yago ni tamata, ka sega ni rawa me caka mai na ivakaraitaki lelevu. Ni vakayagataki na ivakarau oqo, keitou vakadeitaka ni l-kynurenine kei na adenosine, na rua na veivakabulabulataki vinaka oqo e vakacerecerei ena veivakabulabulataki ni T se na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki (iTaba S3, B kei na C). O koya gona, na veika oqo e vakaraitaka na yalodina kei na rawa ni noda veibiu ni sela kei na tekinolaji ni spectrometry levu me kunei kina na metabolites bibi ni bula ena yago ni tauvimate.
Na neitou vakadidike e vakaraitaka talega e dua na veiwasei kaukauwa ni metabolic ni mataqali sela ena loma kei na maliwa ni tauvimate (itaba 2D kei na itaba S4A). Vakabibi, vakatauvatani kei ira na tauvimate tale eso, tauvimate 70 vakaraitaka na duidui ni ivakarau ni metabolic (iTaba 2E kei na itaba S4B), e vakaraitaka ni rawa ni tiko na heterogeneity ni metabolic levu ena maliwa ni tauvimate. E dodonu me da kila ni vakatauvatani kei ira na tauvimate tale eso (1.2 ki na 2 na lita; Teveli S1), na levu taucoko ni ascites e kumuni ena tauvimate 70 (80 ml) e lailai. Na lewa ni heterogeneity ni veimaliwai ni tauvimate ena gauna ni vakadidike ni iwasewase levu (me kena ivakaraitaki, vakayagataki ni vakadidike ni redundancy vakatikina) e vakaraitaka na veisau tudei ena maliwa ni mataqali sela, kei na mataqali sela kei na/se na vanua lalai e matata vinaka na kena vakasoqoni vata me vaka na itukutuku ni metabolite (iTaba 2F ). Na vakadidike ni metabolites duadua e vakabibitaka na veika oqo ka vakaraitaka na duidui levu ena maliwa ni mataqali sela kei na vanua lalai. E dodonu me da kila ni duidui vakaitamera duadua e laurai sai koya na MNA, ka dau vakavutuniyautaki ena CD45- na sela kei na CD4 + kei na CD8 + na sela ka curuma yani na vuvuce (iTaba 3A). Me baleta na CD4 + na sela, na kena revurevu oqo e matata duadua, kei na MNA ena CD8 + na sela talega e vaka me kaukauwa sara na kena vakaleqai na vanua e tiko kina. Ia, e sega ni bibi oqo, baleta ni tolu ga vei ira na ono na tauvimate e rawa ni vakatovotovotaki me baleta na sikoa ni CD8 + ni tumor. Me ikuri ni MNA, ena veimataqali sela ena ascites kei na vuvuce, eso tale na metabolites ka sega ni vinaka na kena ivakatakilakila ena TIL era sa duidui talega na vutuniyau (iTaba S3 kei na S4). O koya gona, na itukutuku oqo e vakaraitaka e dua na ituvatuva yalataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki me baleta na vakadidike tale eso.
(A) Vakatautauvatataki na itukutuku ni MNA ena CD4 +, CD8 + kei na CD45- na sela mai na ascites kei na vuvuce. Na kato ni iyaloyalo e vakaraitaka na veimama (laini), na veimama ni veimama (hinge ni isema) kei na itukutuku ni veimama, me yacova na 1.5 na gauna na veimama ni veimama (whisker ni isema). Me vaka e vakamacalataki ena iyaya ni tauvimate kei na iwalewale, vakayagataka na limma ni tauvimate me vakadeitaka na P na isau (* P <0.05 kei na ** P <0.01). (B) Na iyaloyalo ni ituvatuva ni MNA ni veisau (60). Veika e veisautaki: S-adenosili-1-metionini; SAH, S-adenosina-1-vakatautauvatataki; NA, nikotina; MNA, 1-metilinikotinamidi; 2-PY, 1-metili- 2-piridoni-5-kabokisamidi; 4-PY, 1-metili-4-piridoni-5-kabokisamidi; NR, na nikotinamidi; NMN, dua na nikotinami. Na veivakabulabulataki (drokadroka): NNMT, nikotinamidi N-metili; SIRT, veiqaravi; NAMPT, na veisautaki ni nikotinamidi; AOX1, okisitesi ni aldehaidi 1; NRK, na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki; NMNAT, nikotinami dua na niukilia niukiliti ni veisau; Pnp1, niukilia ni purina. (C) t-SNE ni scRNA-seq ni ascites (vulavula) kei na vuvuce (damudamu; n = 3 na tauvimate). (D) NNMT vakaraitaka ena duidui na iwiliwili ni sela vakatakilai ena kena vakayagataki na scRNA-seq. (E) Vakaraitaka na NNMT kei na AOX1 ena SK-OV-3, na yatevuso ni tamata (HEK) 293T, na sela ni T kei na sela ni T ni MNA-vakayacori. Na vosa e vakacurumi e vakaraitaki me baleta na SK-OV-3. Na ivakarau ni vakaraitaka na SEM e vakaraitaki (n = 6 dausoli ka bulabula). Na Ct e levu cake mai na 35 e vakasamataki me sega ni laurai rawa (UD). (F) Vakaraitaka na SLC22A1 kei na SLC22A2 ena SK-OV-3, HEK293T, T na sela kei na T na sela e qaravi ena 8mM MNA. Na vosa e vakacurumi e vakaraitaki me baleta na SK-OV-3. Na ivakarau ni vakaraitaka na SEM e vakaraitaki (n = 6 dausoli ka bulabula). Na Ct e levu cake mai na 35 e vakasamataki me sega ni laurai rawa (UD). (G) Na itukutuku ni MNA ni sela ena vakacakacakataki bulabula ni dausoli-ka T ni oti na 72 na auwa ni veivakabulabulataki kei na MNA. Na ivakarau ni vakaraitaka na SEM e vakaraitaki (n = 4 dausoli ka bulabula).
MNA e vakayacori ena kena vakadewataki na ilawalawa ni methyl mai na S-adenosyl-1-methionine (SAM) ki na nikotina (NA) ena nikotina N-methyltransferase (NNMT; itaba 3B). NNMT e vakaraitaki vakalevu ena veimataqali kenisa ni tamata ka sa veiwekani kei na kena vakalevutaki, na kena curu yani kei na kena tete (25-27). Me kilai vinaka cake na ivurevure ni MNA ena T na sela ena TME, keitou vakayagataka na scRNA-seq me vakatakilakilataka na vakaraitaki ni NNMT ena veimataqali sela ena ascites kei na vuvuce ni tolu na tauvimate ni HGSC (Teveli S5). Na vakadidike ni rauta ni 6,500 na sela e vakaraitaka ni ena ascites kei na vanua ni vuvuce, NNMT vakaraitaka e vakatabui ki na vakasamataki ni fibroblast kei na vuvuce ni sela iwiliwili (iTaba 3, C kei na D). E dodonu me da kila ni sega ni dua na ivakaraitaki matata ni NNMT ena dua na iwiliwili ni tamata e vakaraitaka na PTPRC (CD45 +) (itaba 3D kei na itaba S5A), ka vakaraitaka ni sa vakacurumi na MNA e kunei ena ivakarau ni metabolite ki na T na sela. Na vakaraitaki ni aldehyde oxidase 1 (AOX1) veisautaka na MNA ki na 1-metili-2-piridoni-5-kabokisamide (2-PYR) se 1-metili-4-piridoni-5-kabokisamide (4-PYR); itaba 3B) e vakatabui talega ki na iwiliwili ni fibroblasts vakaraitaka na COL1A1 (itaba S5A), ka rau vakaraitaka vata ni T na sela e sega na kena rawa ni vakayagataki na MNA vakaitaukei. Na ivakarau ni vakaraitaki ni veitiki ni yago oqo e baleta na MNA a vakadeitaki ena kena vakayagataki e dua na ikarua ni itukutuku ni sela tu vakataki koya e vakarautaki mai na ascites mai vei ira na tauvimate ni HGSC (iTaba S5B; n = 6) (16). Me kena ikuri, na vakadidike ni veivakatautauvatataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki (qPCR) ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni MNA e vakaraitaka ni vakatauvatani kei na lewa SK-OV-3 veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki, NNMT se AOX1 e voleka ni sega ni vakaraitaki (iTaba 3E). Na veika e sega ni namaki oqo e vakaraitaka ni MNA e rawa ni vakatabui mai na fibroblasts se na vuvuce ki na veitiki ni T voleka ena TME.
E dina ga ni o ira na veidigitaki era oka kina na matavuvale ni veivakau cation ni veika bula 1 ki na 3 (OCT1, OCT2 kei na OCT3) encoded mai na matavuvale ni veivakau 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 kei na SLC22A3), na veivakau rawa ni MNA era se sega tikoga ni vakamacalataki (28). QPCR ni mRNA mai na bulabula ni dausoli ka T na sela e vakaraitaka na ivakatagedegede ni vakaraitaki lailai ni SLC22A1 ia na ivakatagedegede ni SLC22A2 e sega ni laurai rawa, ka vakadeitaka ni sa ripotetaki oti ena ivola (iTaba 3F) (29). Ena kena veibasai, na SK-OV-3 laini ni sela ni vuvuce ni ovarian vakaraitaka na ivakatagedegede cecere ni rua na veivakau (iTaba 3F).
Me rawa ni vakatovolei na kena rawa ni T na sela e tiko kina na rawa ni absorb na MNA ni vanua tani, bulabula ni dausoli T na sela era a cultured me baleta na 72 na auwa ena kena tu na duidui ni vakasama ni MNA. Ena kena sega ni tiko na MNA exogenous, na veika e tiko ena sela ni MNA e sega ni rawa ni laurai (iTaba 3G). Ia, vakacakacakataki T na sela e qaravi ena MNA exogenous e vakaraitaka e dua na tubu ni kaukauwa-vakararavi ena MNA na lewena ena sela, me yacova na 6 mM MNA (iTaba 3G). Na macala oqo e vakaraitaka ni dina ga ni lailai na ivakatagedegede ni vakaraitaki ni veivakau kei na lailai ni enzyme levu e vakaitavi ena veisautaki ni MNA ena loma ni sela, e rawa ni se taura tikoga na TIL na MNA.
Na irairai ni metabolites ena tauvimate’ T na sela kei na ena vitro MNA vakatovotovo ni vakatovotovo e vakalevutaka na kena rawa ni fibroblasts ni kenisa-veiwekani (CAF) vakavotukana na MNA kei na sela ni vuvuce e rawa ni vakalawataka na phenotype kei na cakacaka ni TIL. Me kilai na kena revurevu ni MNA ena T na sela, bulabula ni dausoli T na sela era a vakayagataki ena vitro ena kena tiko se sega na MNA, ka vakatovotovotaki na nodra vakalevutaki kei na buli ni cytokine. Ni oti na 7 siga ni kena vakacurumi na MNA ena kena ivakarau cecere duadua, na iwiliwili ni vakaruataki ni iwiliwili e vakalailaitaki vakalailai, ni kaukauwa e maroroi tiko ena ivakarau kece sara (iTaba 4A). Me kena ikuri, na veiqaravi ni MNA exogenous e vakavuna na tubu ni iwiliwili ni CD4 + kei na CD8 + T na sela vakaraitaka na vuvuce ni vuvuce-α (TNFα; itaba 4B). Ena kena veibasai, na kena buli na IFN-γ ena loma ni sela e vakalailaitaki sara vakalevu ena CD4 + T na sela, ia e sega ena CD8 + T na sela, ka sega ni dua na veisau levu ena interleukin 2 (IL-2; itaba 4, C kei na D). O koya gona, na vakatovotovo ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki (ELISA) ni veivakabulabulataki mai na veivakabulabulataki ni T oqo e vakaraitaka e dua na tubu levu ena TNFα, e dua na lailai sobu ena IFN-γ, ka sega ni dua na veisau ena IL-2 (iTaba 4, E ki na G). . Na lailai sobu ni IFN-γ e vakaraitaka ni MNA e rawa ni vakaitavi ena kena tarovi na cakacaka ni veivakacacani ni T na sela. Me rawa ni vakatotomuria na kena revurevu ni MNA ena T sela-vakaveiwekanitaki cytotoxicity, chimeric antigen ciqomi T (FRα-CAR-T) na sela e taketetaka na folate ciqomi α kei na CAR-T (GFP) vakalawataki mai na drokadroka ni fluorescent protein (GFP) -CAR-T) na sela era buli mai na dra bulabula ni dausoli ka. Na sela ni CAR-T era a vakabulabulataki me baleta na 24 na auwa ena mata ni MNA, ka qai vakabulabulataki vata kei na tamata SK-OV-3 na sela ni vuvuce ni ovarian vakaraitaka na folate ni ciqomi α ena dua na effector ki na takete ni ratio ni 10: 1. Na veiqaravi ni MNA e vakavuna e dua na lailai sobu levu ni cakacaka ni veivakamatei ni FRα-CAR-T na sela, ka tautauvata kei na FRα-CAR-T na sela e qaravi ena adenosine (iTaba 4H).
(A) Na iwiliwili taucoko ni sela bulabula kei na iwiliwili ni vakaruataki (PD) vakadodonu mai na itovo vakavanua ena siga 7. Na kalavo ni bar e vakaraitaka na kena ibalebale + SEM ni ono na dausoli ka bulabula. E vakaraitaka na itukutuku mai na lailai duadua n = 3 na veivakatovolei tudei. (B ki na D) CD3 / CD28 kei na IL-2 era vakayagataki me ra vakabulabulataka na T na sela ena nodra dui MNA vakasama me baleta na 7 na siga. Ni bera na vakadidike, era a vakauqeti na sela ena PMA / ionomycin vata kei na GolgiStop me baleta na 4 na auwa. TNFα (B) vakaraitaka ena T na sela. Na ivakaraitaki ni iyaloyalo (imawi) kei na itukutuku tabular (matau) ni TNFα vakaraitaka ena sela bula. IFN-γ (C) kei na IL-2 (D) vakaraitaka ena T na sela. Na vakaraitaki ni veisele e vakarautaki ena drodro ni veisele. Na kalavo ni barausa e vakaraitaka na kena ibalebale (n = 6 dausoli ka bulabula) + SEM. Vakayagataka e dua na sala ni vakadidike ni veisau kei na veivakatovolei vakawasoma (* P <0.05 kei na ** P <0.01) me vakadeitaka na isau ni P. E vakaraitaka na itukutuku mai na lailai duadua n = 3 na veivakatovolei tudei. (E ki na G) CD3 / CD28 kei na IL-2 era vakayagataki me ra vakabulabulataka na T na sela ena nodra dui MNA vakasama me baleta na 7 siga. Na veimaliwai e a kumuni ni bera kei na oti na 4 na auwa ni PMA / ionomycin veivakauqeti. Na vakasama ni TNFα (E), IFN-γ (F) kei na IL-2 (G) a vakarautaki ena ELISA. Na kalavo ni bara e vakaraitaka na kena ibalebale (n = 5 dausoli ka bulabula) + SEM. P na isau e vakadeitaki ena kena vakayagataki e dua na sala ni vakadidike ni veisau kei na veivakatovolei vakawasoma (* P <0.05). Na laini dotted e vakaraitaka na iyalayala ni kena kunei na kena kunei. (H) Vakatovotovo ni lysis ni sela. FRα-CAR-T se GFP-CAR-T na sela era a vakadodonutaki vata kei na adenosine (250 μM) se MNA (10 mM) me baleta na 24 na auwa, se biu tu vakatikitiki (Ctrl). E vakarautaki na pasede ni mate ni SK-OV-3 na sela. P na isau e vakadeitaki ena veivakatovolei ni t ni Welch (* P <0.5 kei na ** P <0.01).
Me rawa ni rawati e dua na kila vakamisini ni MNA-vakararavi TNFα vakaraitaka na lawatu, na veisau ena TNFα mRNA ni MNA-vakayacori T na sela era a vakatovotovotaki (itaba 5A). Na bulabula ni dausoli ka T na sela e qaravi ena MNA e vakaraitaka e dua na tubu vakarua ena TNFα na ivakatagedegede ni volavola, e vakaraitaka ni MNA e vakararavi ena TNFα na lawa ni volavola. Me vakadikevi na iwalewale ni veivakalawataki e rawa oqo, e rua na ka kilai ni volavola ka vakalawataka na TNFα, oya na vakacakacakataki ni T niukilia ni sela (NFAT) kei na protein vakatabakidua 1 (Sp1), era a vakatovotovotaki ena kena saumi na MNA ni vesuki ki na veivakatorocaketaki ni TNFα voleka ( 30). Na TNFα veivakatorocaketaki e tiko kina na 6 vakatakilakilataki NFAT vanua ni vesuki kei na 2 Sp1 vanua ni vesuki, veicurumaki ena dua na vanua [-55 yavu ni veiwatini (bp) mai na 5'cap] (30). Na veivakabulabulataki ni chromatin (ChIP) e vakaraitaka ni gauna e qaravi kina na MNA, na vesuki ni Sp1 ki na TNFα veivakatorocaketaki e tubu vakatolu. Na kena vakacurumi talega na NFAT e vakalevutaka ka volekata na kena bibi (iTaba 5B). Na itukutuku oqo e vakaraitaka ni MNA e vakalawataka na vakaraitaki ni TNFα ena Sp1 volavola, kei na dua na ivakatagedegede lailai na vakaraitaki ni NFAT.
(A) Ni vakatauvatani kei na T na sela e vakabulabulataki ka sega na MNA, na veisau ni fold ni TNFα vakaraitaka ena T na sela e qaravi ena MNA. Na ivakarau ni vakaraitaka na SEM e vakaraitaki (n = 5 dausoli ka bulabula). E vakaraitaka na itukutuku mai na lailai duadua n = 3 na veivakatovolei tudei. (B) Na TNFα veivakatorocaketaki ni T na sela e qaravi vata kei na sega na 8 mM MNA ni oti na NFAT kei na Sp1 era a cokovata kei na (Ctrl) kei na PMA / ionomycin veivakauqeti me baleta na 4 na auwa. Na immunoglobulin G (IgG) kei na H3 era vakayagataki me vaka na lewa ca kei na vinaka me baleta na immunoglobulin, vakatautauvata. Na vakarautaki ni ChIP e vakaraitaka ni kena vauci na Sp1 kei na NFAT ki na TNFα veivakatorocaketaki ena MNA-vakabulabulataki na sela e vakalevutaki ena vica na gauna ni vakatauvatani kei na kena lewa. E vakaraitaka na itukutuku mai na lailai duadua n = 3 na veivakatovolei tudei. P na isau e vakadeitaki ena vuqa na t-vakatovotovo (*** P <0.01). (C) Ni vakatauvatani kei na ascites ni HGSC, T na sela (sega ni vakacacani) e vakaraitaka na vakalevutaki ni vakaraitaki ni TNF ena vuvuce. Na roka e vakatakarakarataka na tauvimate duidui. Na sela vakaraitaki sa vakatovotovotaki vakaveitalia ki na 300 ka jittered me vakaiyalayala na droini vakasivia (** Padj = 0.0076). (D) Vakatututaki na ivakaraitaki ni MNA me baleta na kenisa ni ovarian. Na MNA e buli ena sela ni vuvuce kei na fibroblasts ena TME ka taura cake na sela ni T. MNA vakalevutaka na vesuki ni Sp1 ki na TNFα veivakatorocaketaki, ka vakavuna na vakalevutaki ni TNFα volavola kei na TNFα cytokine buli. E vakavuna tale ga na MNA me lailai sobu na IFN-γ. Na kena tarovi na cakacaka ni T cell e vakavuna me lailai kina na rawa ni veivakamatei kei na totolo ni tubu ni tumor.
Me vaka na itukutuku, TNFα e liu kei na muri-vakararavi na veivakacacani kei na veivakacacani, ia e tiko e dua na itavi kilai levu ena kena vakatorocaketaki na tubu kei na metastasis ni kenisa ni ovarian (31-33). Me vaka na itukutuku, na vakasama ni TNFα ena ascites kei na yago ni vuvuce ena tauvimate kei na kenisa ni ovarian e cecere cake mai na kena ena yago benign (34-36). Ena vuku ni iwalewale, TNFα e rawa ni vakalawataka na vakabulabulataki, cakacaka kei na vakalevutaki ni dra vulavula, ka veisautaka na phenotype ni sela ni kenisa (37, 38). Me salavata kei na veika e kune oqo, na vakadidike ni vakaraitaki ni gene duidui e vakaraitaka ni TNF e vakalevutaki cake-vakalawataki ena T na sela ena veitiki ni yago ni vakatauvatani kei na ascites (iTaba 5C). Na tubu ni TNF vakaraitaka e laurai ga ena T na iwiliwili ni sela kei na dua na sega ni cytotoxic na ivakatakilakila (iTaba S5A). Me vakalekalekataki, na itukutuku oqo e tokona na rai ni MNA e rua na kena immunosuppressive kei na kena vakatorocaketaki na vuvuce ena HGSC.
Na vakatakilakilataki ni lumilumisa e yavutaki ena drodro ni cytometry sa yaco me iwalewale levu duadua me baleta na vulici ni TIL ni veisau. Na vakadidike oqo e vakaraitaka ni vakatauvatani kei na dra ni dra se na T mai na ikarua ni gacagaca ni dra, na murine kei na tamata TIL e dua na ivakarau cecere me taura na suka (4, 39) kei na kena yali vakamalua na cakacaka ni mitochondrial (19, 40). Dina ga ni da sa raica na veika vata ga ena vakadidike oqo, na veivakatorocaketaki bibi sai koya me vakatautauvatataki na metabolism ni sela ni vuvuce kei na TIL mai na resected vata ga na vuvuce ni vuvuce. Me salavata kei na so na ripote sa oti oqo, na vuvuce (CD45-EpCAM +) na sela mai na ascites kei na vuvuce e cecere cake na kena vakayagataki mai na CD8 + kei na CD4 + T na sela, ka tokona ni rawa ni vakatauvatani kei na T na sela ni suka cecere. Na vakasama ni veisisivi ni T sela. TME. Ia, na cakacaka ni mitochondrial ni sela ni tumor e cecere cake mai na CD8 + T sela, ia na cakacaka ni mitochondrial e tautauvata kei na CD4 + T sela. Na veika oqo e vakaukauwataka na ulutaga tubu cake tiko ni sa bibi na veisautaki ni oxidative me baleta na sela ni vuvuce (41, 42). Era vakaraitaka talega ni CD8 + T na sela e rawa ni vakaleqai vakalevu cake mai na CD4 + T na sela, se na CD4 + T na sela e rawa ni vakayagataka na ivurevure ni kaboni tale eso mai na suka me maroroi kina na cakacaka ni mitochondrial (43, 44). E dodonu me kilai ni keitou raica ni sega ni dua na duidui ena suka se na cakacaka ni mitochondrial ena maliwa ni CD4 + T veivakauqeti, T veivakauqeti vakanananu kei na T vakanananu ni lomadonu ni sela ena ascites. Vakakina, na ituvaki ni duidui ni CD8 + T na sela ena vuvuce e sega ni dua na ka me baleta na veisau ni suka, vakaraitaka na duidui levu ena maliwa ni T na sela e susugi ena vitro kei na tamata TIL ena vivo (22). Na veika oqo e vakadeitaki talega ena kena vakayagataki na veisoliyaki ni iwiliwili ni sela vakataki koya sega ni veivakaduiduitaki, ka vakaraitaka tale ni CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + na sela kei na cecere ni suka kei na cakacaka ni mitochondrial mai na sela ni vuvuce era sa takalevu ia e tiko vei ira na iwiliwili ni sela gugumatua ni Metabolic. Na iwiliwili oqo e rawa ni matataka na iwiliwili lailai ni vakasama ni veivakacacani ni myeloid se na veivakacacani ni plasmacytoid e laurai ena vakadidike ni scRNA-seq. E dina ga ni rau sa ripotetaki ruarua oqo ena veivakacacani ni tamata [45], era se gadreva tikoga Na cakacaka tale eso me vakamacalataki kina na iwiliwili lailai ni myeloid oqo.
E dina ga ni drodro cytometry-yavutaki na iwalewale e rawa ni vakamatatataka na duidui raraba ena suka kei na oxidative ni veisau ena maliwa ni mataqali sela, na veisau dodonu e vakavuna na suka se so tale na ivurevure ni kaboni me baleta na veisau ni mitochondrial ena TME e se bera ni vakadeitaki. Na kena lesi na tiko se sega na metabolites ki na dua na iwasewase lailai ni TIL e soli e gadrevi kina na vakasavasavataki ni iwiliwili ni sela mai na yago excised. O koya gona, na noda iwalewale ni vakavutuniyautaki ni sela vata kei na spectrometry levu e rawa ni vakarautaka na vakasama ki na metabolites ka duidui na kena vakavutuniyautaki ena T sela kei na iwiliwili ni sela ni tumor ena kena veiganiti na ivakaraitaki ni tauvimate. E dina ga ni iwalewale oqo e vinaka cake mai na fluorescence-vakacakacakataki na sela ni veiwasei, eso na valenivolavola ni metabolite e rawa ni vakaleqai ena vuku ni tudei ni inherent kei na/se totolo na iwiliwili ni veisau (22). Ia, na neitou iwalewale e rawa ni vakatakila e rua na kilai ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki, adenosine kei na kynurenine, baleta ni ra duidui sara vakalevu ena maliwa ni mataqali ivakaraitaki.
Na noda vakadidike ni metabolinomic ni veivakacacani kei na TIL e solia e levu cake na vakasama me baleta na itavi ni veivakacacani ena TME ni ovarian. Taumada, vakayagataka na drodro ni cytometry, keitou vakadeitaka ni sega ni dua na duidui ena cakacaka ni mitochondrial ena maliwa ni veivakacacani kei na CD4 + T na sela. Ia, na vakadidike ni LC-MS / MS e vakaraitaka na veisau levu ena levu ni veivakacacani ena kedra maliwa na iwiliwili oqo, ka vakaraitaka ni vakatulewa me baleta na TIL ni veivakacacani kei na kena cakacaka raraba ni veivakacacani e gadrevi kina na vakadewataki vakavinaka. iKarua, MNA na metabolite kei na duidui levu duadua ena maliwa ni CD45-sela kei na T sela ena ascites, sega ni vuvuce. O koya gona, na veiwasewase kei na vanua ni tumor e rawa ni duidui na kena revurevu ena TIL ni veisau, ka vakaraitaka na kena rawa ni heterogeneity ena dua na vanua lalai e soli. iKatolu, na vakaraitaki ni MNA-vakatubura enzyme NNMT e vakaiyalayala vakalevu ki na CAF, sai koya na sela ni vuvuce ki na dua na ivakatagedegede lailai, ia na ivakatagedegede ni MNA e rawa ni laurai e laurai ena vuvuce-vakatubura na sela ni T. Na vakalevutaki ni NNMT ena CAF ni ovarian e dua na kena revurevu kilai ni kenisa-vakatorocaketaka, e dua na tiki ni kena vakatorocaketaki na CAF ni veisau, na curu ni vuvuce kei na metastasis (27). E dina ni vakatautauvatataki na ivakatagedegede raraba ni TIL, na vakaraitaki ni NNMT ena CAF e veivolekati sara kei na kenisa ni kenisa ni kenisa (TCGA) na mataqali lailai ni mesenchymal, ka sa veiwekani kei na dravudravua ni vakasama (27, 46, 47). Kena itinitini, na vakaraitaki ni enzyme AOX1 e vakavuna na vakacacani ni MNA e vakaiyalayala talega ki na iwiliwili ni CAF, ka vakaraitaka ni T na sela e sega na kena rawa ni veisautaki na MNA. Na veika oqo e tokona na vakasama ni dina ga ni gadrevi eso tale na cakacaka me vakadeitaka na kunei oqo, na ivakatagedegede cecere ni MNA ena T na sela e rawa ni vakaraitaka na kena tiko e dua na vanua lailai ni CAF ni veivakabulabulataki.
Ni soli na ivakatagedegede ni vakaraitaki lailai ni MNA veivakau kei na ivakatagedegede sega ni laurai rawa ni protein bibi e vakaitavi ena MNA metabolism, na tiko ni MNA ena T na sela e sega ni namaki. E sega ni rawa ni kunei na NNMT se AOX1 ena vakadidike ni scRNA-seq kei na qPCR ni takete ni rua na ilawalawa tudei. Na veika oqo e vakaraitaka ni MNA e sega ni vakarautaki mai na T na sela, ia e vakayagataki mai na TME wavolita. Ena veivakatovolei ni vitro e vakaraitaka ni T na sela e dau vakasoqona na MNA exogenous.
Na noda vakadidike ena vitro e vakaraitaka ni MNA exogenous e vakavuna na vakaraitaki ni TNFα ena T na sela ka vakatorocaketaka na kena vauci na Sp1 ki na TNFα ni veivakatorocaketaki. E dina ga ni TNFα e rua na cakacaka ni veivakacacani kei na veivakacacani, ena kenisa ni yatevuso, TNFα e rawa ni vakatorocaketaka na tubu ni kenisa ni yatevuso (31-33). Na vakamalumalumutaki ni TNFα ena itovo vakavanua ni sela ni vuvuce ni ovarian se na kena vakaoti na sikinala ni TNFα ena ivakaraitaki ni mouse e rawa ni vakavinakataka na TNFα-vakaveiwekanitaki na buli ni cytokine ni vuvuce ka vakataotaka na tubu ni vuvuce (32, 35). O koya gona, ena kisi oqo, TME-vakadewataki MNA e rawa ni cakacaka me vaka e dua na metabolite pro-vakacacani ena dua na iwalewale ni TNFα-vakararavi ena sala ni autocrine, ka vakavuna kina na kena yaco kei na kena tete na kenisa ni ovarian (31). Me vaka na kena rawa oqo, TNFα vakatabui e sa vulici tiko me vaka e dua na veiqaravi ni veivakabulabulataki rawarawa me baleta na kenisa ni yatevuso (37, 48, 49). Me kena ikuri, MNA vakaleqa na cytotoxicity ni CAR-T na sela ki na sela ni vuvuce ni ovarian, ka vakarautaka eso tale na ivakadinadina me baleta na MNA-veimaliwai ni veivakabulabulataki ni itataqomaki. Me vakasoqoni vata, na veika oqo e vakaraitaka e dua na ivakaraitaki ena kena vakatuburi na MNA ki na TME ni CAF. Ena (i) TNF-vakavuna na tubu ni kenisa ni ovari kei na (ii) MNA-vakavuna na T sela cytotoxic cakacaka ni veivakacacani, oqo e rawa ni dua na kena revurevu ni vuvuce ruarua (iTaba 5D).
Me kena itinitini, ena kena vakayagataki e dua na isoqoni ni totolo ni vakavutuniyautaki ni sela, dua ga na sela ni veitarataravi kei na itukutuku ni metabolic, na vakadidike oqo e vakaraitaka na duidui levu ni immunometabolomic ena maliwa ni vuvuce kei na sela ni ascites ena tauvimate ni HGSC. Na vakadidike raraba oqo e vakaraitaka ni tiko na duidui ena kena tauri na suka kei na cakacaka ni mitochondrial ena maliwa ni T na sela, ka vakaraitaka na MNA me vaka e dua na sega ni sela vakataki koya na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki. Na itukutuku oqo e tiko na kena revurevu ena sala e tara kina na TME na T sela ni veisau ena kenisa ni tamata. Dina ga ni sa ripotetaki na veisisivi vakadodonu me baleta na kakana ena maliwa ni T na sela kei na sela ni kenisa, na metabolites e rawa talega ni cakacaka me vaka na veivakadodonutaki sega ni vakadodonu me vakatorocaketaka na toso ni tumor ka rawa ni vakamalumalumutaka na isau ni itataqomaki ni endogenous. Na ivakamacala tale ni itavi ni cakacaka ni metabolites ni veivakalawataki oqo e rawa ni dolava na iwalewale tale eso me baleta na kena vakatorocaketaki na isau ni itataqomaki ni anti-tumor.
Na ivakaraitaki ni tauvimate kei na itukutuku ni valenibula e rawati ena BC kenisa ni tumor ni yago ni maroroi ni yago vakadeitaki mai na rede ni maroroi ni yago ni Kenada. Me vaka na ivakarau e vakadonuya na Komiti ni itovo ni vakadidike ni kenisa ni BC kei na Univesiti ni Peritania (H07-00463), na ivakaraitaki kece ni tauvimate kei na itukutuku ni valenibula e rawata na veivakadonui vakaivola se vakamatanitu waived na nodra veivakadonui. Na ivakaraitaki era maroroi tu ena BioBank vakadeitaki (BRC-00290). Na itovo matailalai ni tauvimate e vakaraitaki ena Teveli S1 kei na S5. Me baleta na cryopreservation, e vakayagataki e dua na scalpel me vakacacana vakamisini na ivakaraitaki ni tumor ni tauvimate ka qai biuta ena dua na 100-micron na filita me rawati kina e dua na vakacegu ni sela. Na ascites ni tauvimate e a vakadrodroi ena 1500 rpm me baleta na 10 na miniti ena 4 ° C me pellet na sela ka kauta laivi na wai e cake. Na sela e rawati mai na vuvuce kei na ascites era a maroroi tu ena 50% na katakata ni tamata AB serum (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (vakasaenisi ni dauqoli katakata) kei na 10% dimethyl sulfoxide. Na veivakabulabulataki ni dua ga na sela maroroi oqo era a vakawaicalataki ka vakayagataki me baleta na veivakabulabulataki kei na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki e vakamacalataki e ra.
Na veimama taucoko e tiko kina na 0.22 μm vakasavasavataki 50:50 vakaikuritaki RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mm l-glutamine (vakasaenisi ni dauqoli katakata) vakaikuritaki ena 10% katakata-inactivado serum AB humano (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (vakasaenisi ni dauqoli katakata), 2 mM l-glutamine (vakasaenisi ni dauqoli katakata) Streptomycin (PenStrep) iwali (vakasaenisi ni dauqoli katakata) kei na 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) e vakaikuritaki ena 20 mM Hepes (vakasaenisi ni dauqoli ni katakata) kei na 2 mM l-glutamine (vakasaenisi ni dauqoli ni katakata). Na drodro ni cytometer ni vakacaca ni vakacaca e oka kina na 0.22μm vakasavasavataki ni vakacaca ni wai (PBS; Invitrogen) vakaikuritaki ena 3% katakata-sega ni vakayagataki AB na dra ni tamata (Sigma). Na buffer ni vakavutuniyautaki ni sela e vakarautaki mai na 0.22μm PBS vakasavasavataki ka vakaikuritaki ena 0.5% katakata-vakacacani ni tamata AB ni dra (Sigma-Aldrich).
Ena 37 ° C taucoko na veimama, era a vakacacani na sela ena 10 nM MT DR kei na 100 μM 2-NBDG me baleta na 30 na miniti. Tarava, na sela era a vakacacani ena bulabula ni roka eF506 ena 4°C me baleta na 15 na miniti. Resuspend na sela ena FC buloko (eBioscience) kei na kaukauwa ni vakacacani ni vakacacani (BD Biosciences), vakalailaitaka ena drodro ni cytometer vakacacani buffer (me vaka na veidusimaki ni dauteitei), ka vakatubura me baleta na 10 na miniti ena ivakarau ni katakata ni rumu. Vakacacana na sela ena dua na ilawalawa ni veivakabulabulataki (Teveli S2) ena drodro ni cytometry vakacacana na buffer ena 4 ° C me baleta na 20 na miniti. Vakasuka tale na sela ena drodro ni cytometry ni veivakacacani (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R ituvatuva) ni bera na vakadidike. Vakayagataka na SpectroFlo kei na FlowJo V10 me dikevi kina na itukutuku ni wiliwili ni sela, ka vakayagataka na GraphPad Prism 8 me buli kina na itukutuku. Na kaukauwa ni fluorescence ni veimama (MFI) ni 2-NBDG kei na MT DR a log-vakatautauvatataki, ka qai vakayagataki e dua na veivakatovolei ni t veiwatini me baleta na vakadidike ni iwiliwili me vakamacalataki kina na tauvimate veiganiti. Kauta laivi na iwiliwili kece e lailai mai na 40 na ka e yaco mai na vakadidike; vakacuruma e dua na MFI na isau ni 1 me baleta e dua na isau ca ni bera ni vakayacori na vakadidike ni iwiliwili kei na itukutuku ni vakaraitaki.
Me rawa ni vakaikuritaka na iwalewale ni gating ni ivola ni ilawalawa ni iwalewale e cake, keitou vakayagataka na ivakamacala taucoko mai na vunikau ni vakatabui ni ibulibuli (FAUST) (21) me lesi vakataki koya na sela ki na iwiliwili ni oti na kena vakaoti na sela mate ena FlowJo. Eda vakayagataka vakataki keda na output me cokovata na iwiliwili ni tamata e vaka me sa vakayagataki cala (vakaduavatataki na PD1 + kei na PD1-tumor na sela) kei na iwiliwili maroroi. Na ivakaraitaki yadua e tiko kina e dua na ivakatautauvata ni sivia na 2% na sela, me baleta e dua na iwiliwili ni 11 na iwiliwili.
E vakayagataki na ficoll na kaukauwa ni kaukauwa ni kaukauwa me wasei kina na PBMC mai na iyaya ni veiwasei ni leukocyte (TEkinolaji ni stemCELL). CD8 + T na sela era a vakatikitikitaki mai na PBMC ena kena vakayagataki na CD8 MicroBeads (Miltenyi) ka vakarabailevutaki ena taucoko ni veimaliwai ena kena vakayagataki na TransAct (Miltenyi) me baleta na 2 na macawa me vaka na veidusimaki ni dauteitei. Na sela era a vakatarai me ra tu me baleta na 5 siga ena taucoko ni veimaliwai e tiko kina na IL-7 (10 ng / ml; PeproTech), ka qai vakauqeti tale ena TransAct. Ena siga 7, me vaka na veidusimaki ni dau buli iyaya, a vakayagataki na CD45 MicroBeads ni tamata (Miltenyi) me vakavutuniyautaki kina na sela ena tolu na rauni veitaravi. Na sela era a vakarautaki me baleta na vakadidike ni drodro ni cytometry (me vaka e vakamacalataki e cake), kei na dua na milioni na sela era a vakarautaki vakatolu me baleta na vakadidike ni LC-MS / MS. Na ivakaraitaki era a vakayacori ena LC-MS/MS me vaka e vakamacalataki e ra. Keitou vakasamataka na isau ni veisautaki ni yali kei na dua na naba ni ion ni 1,000. Na ivakaraitaki yadua e vakatautauvatataki ena naba ni ion taucoko (TIC), veisautaki vakalogarithmically ka vakatautauvatataki vakataki koya ena MetaboAnalystR ni bera na vakadidike.
Na dua ga na sela ni vakacegu ni tauvimate yadua e thawed ka vakasavasavataki ena dua na 40 μm vakasavasavataki ki na taucoko ni veimama (me vaka e vakamacalataki e cake). Me vaka na ivakarau ni dau buli iyaya, e tolu na veitaravi ni digidigi vinaka ena veiwasei ni bead ni makeneta ena kena vakayagataki na MicroBeads (Miltenyi) a vakayagataki me vakavutuniyautaki kina na ivakaraitaki me baleta na CD8 +, CD4 + kei na CD45- na sela (ena aisi). Me vakalekalekataki, na sela era sa vakavoutaki tale ena buffer ni vakavutuniyautaki ni sela (me vaka e vakamacalataki e cake) ka wiliki. Na sela era a vakasucumi ena CD8 ni tamata, na CD4 ni tamata se na CD45 ni tamata (Miltenyi) ena 4°C me baleta na 15 na miniti, ka qai savati ena buffer ni vakavutuniyautaki ni sela. Na ivakaraitaki e lako sivita na duru ni LS (Miltenyi), ka ra kumuni na veitiki vinaka kei na ca. Me rawa ni vakalailaitaki na balavu ka vakalevutaki na ikalawa ni vakabulabulataki ni sela, na CD8-tikina e qai vakayagataki me baleta na ikarua ni rauni ni CD4 + vakavutuniyautaki, kei na CD4-tikina e vakayagataki me baleta na CD45-vakavutuniyautaki e tarava. Me tiko na iwali ena aisi ena gauna taucoko ni veibiu.
Me vakarautaki na ivakaraitaki me baleta na vakadidike ni metabolite, na sela era a savati vakadua ena iwali ni masima batabata-aisi, kei na 1 ml ni 80% methanol a vakacurumi ki na ivakaraitaki yadua, qai vortexed ka vakamamacataki ena wai ni natrogen. Na ivakaraitaki era a vakayacori ki na tolu na veisau ni vakamamacataki-vakamamacataki ka vakamamacataki ena 14,000 rpm me baleta na 15 na miniti ena 4°C. Na wai e tiko kina na veisau e vakawaicalataki me yacova ni sa mamaca. Na veivakabulabulataki era a vakawabokotaki tale ena 50 μl ni 0.03% na asidi ni fomiki, vortexed me veiwaki, ka qai vakawabokotaki me kau laivi na benu.
Vakasuka na veisau me vaka e vakamacalataki mai cake. Tosoya na wai e cake ki na dua na tavaya ni wai ni cakacaka cecere me baleta na vakadidike ni metabolomics. Vakayagataka e dua na ivakarau ni veiqaravi random me qaravi kina na ivakaraitaki yadua ena dua na iwiliwili tautauvata ni sela me tarova na kena revurevu ni batch. Keitou vakayacora e dua na vakatovotovo ni ivakarau ni metabolites ni vuravura raraba sa tabaki oti ena AB SCIEX QTRAP 5500 vakatolu na vakatovotovo ni vakatovotovo ni vakatovotovo (50). Na vakadidike ni roka kei na vanua cecere ni veivakaduavatataki e vakayacori ena kena vakayagataki na parokaramu ni komipiuta ni MultiQuant 2.1 (Vakayagataki na veika bula SCIEX).
E dua na ion wiliwili ni 1000 a vakayagataki me vakatautauvatataki kina na isau ni metabolite yali, kei na TIC ni ivakaraitaki yadua e vakayagataki me vakarautaki kina na vanua ni cecere ni ivakarau ni metabolite yadua e kunei me vakadodonutaki kina na veisau e vakacurumi mai na vakadidike ni iyaya ni cakacaka mai na ivakaraitaki ni cakacaka. Ni oti na TIC sa vakatautauvatataki, MetaboAnalystR (51) (paramita taumada) e vakayagataki me baleta na saumaki mai ni logarithmic kei na ivakarau ni laini ni ivakarau vakataki koya. Keitou vakayagataka na PCA kei na vegan R pakete me vakayacora na vakadidike ni vakadidike ni duidui ni metabolome ena maliwa ni mataqali ivakaraitaki, ka vakayagataka na vakadidike ni redundancy vakatikina me vakadikevi kina na tauvimate. Vakayagataka na iwalewale ni Ward me tara kina e dua na mape ni katakata dendrogram me vakasoqoni vata na yawa ni Euclidean ena maliwa ni ivakaraitaki. Keitou vakayagataka na limma (52) ena vakatautauvatataki ni levu ni veisautaki me kilai kina na duidui levu ni veisautaki ena veimataqali sela taucoko kei na vanua lalai. Me rawa ni vakarawarawataki na ivakamacala, eda vakayagataka na ilawalawa kena ibalebale paramita me vakaraitaka na ivakaraitaki, ka vakasamataka na mataqali sela ena microenvironment me vaka na ilawalawa yadua (n = 6 ilawalawa); me baleta na veivakatovolei ni bibi, keitou vakayacora e tolu na veivakatovolei vakawasoma me baleta na metabolite yadua Me rawa ni kakua ni vakavotukanataki lasu, a okati na tauvimate me vaka e dua na veivakataotaki ena ituvatuva ni limma. Me rawa ni dikevi na duidui ni metabolites ena maliwa ni tauvimate duidui, keitou veisautaka na ivakaraitaki ni limma oka kina na tauvimate ena dua na sala tudei. Eda ripotetaka na bibi ni veibasai ni bera ni vakamacalataki ena maliwa ni mataqali sela kei na vanua lalai ni Padj <0.05 (vakadodonutaki ni Benjamini-Hochberg).
Ni oti na vakavutuniyautaki ni kaukauwa ena kena vakayagataki na Miltenyi mate na sela ni kau laivi ni iyaya (> 80% bula rawati koya), e dua na sela ni volavola ni veitarataravi a vakayacori ena taucoko ni bula ni ascites batabata kei na ivakaraitaki ni tumor ena kena vakayagataki e dua na 10x 5 'gene vakaraitaka na ivakarau. E lima na kisi kei na veiganiti ni vuvuce kei na ascites era a vakadikevi, e dina ga ni lailai na bula rawati koya mai na dua na ivakaraitaki ni vuvuce e tarova na kena okati. Me rawa ni rawati e vuqa na digidigi ni tauvimate, keitou a cokovata na ivakaraitaki ni tauvimate yadua ena veisala ni 10x chromium ni lewa, ka vakadikeva na ascites kei na vanua ni tumor vakatikitiki. Ni oti na veitarataravi [Vakararamataka na HiSeq 4000 28 × 98 bp itinitini ni veiwatini (PE), na genome ni Quebec; e dua na ivakatautauvata ni 73,488 kei na 41,378 wilika ena dua na sela me baleta na vuvuce kei na ascites vakatautauvata]], keitou vakayagataka na CellSNP kei na Vireo (53) (yavutaki ena CellSNP me vaka Na SNP ni tamata raraba (VCF) e vakarautaka na GRCh38 e lesi e dua na ivakatakilakila ni dausoli-ka. (IBS), sega ni okati kina na sela sega ni lesi kei na sela vakatakilakilataki me vaka na duplexes kei na veiganiti ni dausoli ka ena maliwa ni ascites kei na ivakaraitaki ni vuvuce (54), keitou maroroya e tolu na kisi kei na levu ni matataki ni sela ena vuvuce kei na ascites me baleta na vakadidike ni sobu (sc5o) a rawata na 6975 na sela (2792 kei na 4183 na sela mai na vuvuce kei na ascites, vakatautauvata) me baleta na vakadidike Eda vakayagataka na igraph ni (57) Louvain ni veiwaseitaki ni rede ni veiwekani voleka duadua (SNN) yavutaki ena Jaccard na yawa ki na ilawalawa ni sela ena vakaraitaka na ilawalawa era a vakamacalataki ena liga. kei na vakaraitaki vata kei na t-SNE na sela ni T ni Cytotoxic e vakamacalataki ena kena vakaraitaki na CD8A kei na GZMA, sega ni oka kina na ilawalawa lalai kei na vakaraitaki ni protein lailai ni ribosomal Keitou rawata na itukutuku tabaki ni Izar kei na so tale (16), oka kina na nodra t-SNE vakacurumi ena maliwa ni sela ni itataqomaki.
PBMC era a tawasei mai na iyaya ni veiwasei ni leukocyte (TEkinolaji ni stemCELL) mai na Ficoll ni veivakatorocaketaki ni veivakatorocaketaki ni veivakatorocaketaki. Na CD3 + na sela era a vakatikitikitaki mai na PBMC ena kena vakayagataki na CD3 na mataniciva (Miltenyi). Ena kena tiko se sega na MNA, CD3 + na sela era a vakacakacakataki ena peleti-vakadeitaki CD3 (5 μg / mililita), CD28 vakawaicalataka (3 μg / mililita) kei na IL-2 (300 U / mililita; Proleukin). Ena iotioti ni siga ni vakarabailevutaki, na rawa-ka (vakadodonutaki rawa-ka ni roka eFluor450, eBioscience) kei na kena vakalevutaki (123 wiliwili eBeads, vakasaenisi ni dauqoli ni katakata) era a vakatovotovotaki ena drodro ni cytometry. Vakatovotovotaka na cakacaka ni effector ena kena vakauqeti na sela ena PMA (20 ng/ml) kei na ionomycin (1 μg/ml) vata kei na GolgiStop me baleta na 4 na auwa, ka raica na CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) (Mab11, Bd). Vakauqeta na qPCR kei na ChIP na sela kei na PMA (20 ng/ml) kei na ionomycin (1μg/ml) me baleta na 4 na auwa. Na ELISA vakaitamera a vakasoqoni vata ni bera kei na oti na veivakauqeti ena PMA (20 ng/ml) kei na ionomycin (1 μg/ml) me baleta na 4 na auwa.
Muria na ivakarau ni dauteitei me vakatikitikitaki kina na RNA ena kena vakayagataki na RNeasy vata kei na iyaya lailai (QIAGEN). Vakayagataka na QIAshredder (QIAGEN) me vakatautauvatataki kina na ivakaraitaki. Vakayagataka na RNA cecere-kaukauwa ki na iyaya ni cDNA (Thermo dauqoli vakasaenisi) me vakaduria na DNA veitokoni (cDNA). Vakayagataka na TaqMan totolo toso ki liu na iVakavuvuli Mix (Thermo Fisher vakasaenisi) me vakalevutaka na ivakaraitaki ni gene (me vaka na ivakarau ni daubuliyaya) kei na veivakatarogi oqo: [GAPDH) y Hs01010726_m1 (SLC22A2). Na ivakaraitaki era a cici ena ivakarau ni PCR ni gauna dina ni StepOnePlus (Vakayagataki na veika bula) (Vakayagataki na veika bula) ena MicroAmp totolo ni mata 96-vinaka peleti ni veivakacacani (Vakayagataki na veika bula) vata kei na iyaloyalo ni mata ni MicroAmp. Na Ct cava ga e sivia na 35 e vakasamataki me tiko e cake mai na ivakatagedegede ni kena kunei ka vakatakilakilataki me sega ni kunei rawa.
Vakayacora na ChIP me vaka sa vakamacalataki oti (58). Me vakalekalekataki, na sela era a vakayagataki ena formaldehyde (iotioti ni vakasama 1.42%) ka vakacurumi ena ivakarau ni katakata ni rumu me baleta na 10 na miniti. Vakayagataka na ikuri ni vuvuce ni veivakabulabulataki (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl kei na 0.1% NP-40) ena aisi me baleta na 10 na miniti, qai vakasuka tale ena veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki me vaka e vakamacalataki (58 ). Na ivakaraitaki a qai sonicated vata kei na veisau oqo: 10 veisau (20 1-ikarua ni pulses) kei na dua na gauna static ni 40 na ikarua. Vakatubura na ChIP-kalasi immunoglobulin G (tekinolaji ni ivakatakilakila ni sela; 1μl), histone H3 (tekinolaji ni ivakatakilakila ni sela; 3μl), NFAT (invitrogen; 3μl) kei na SP1 (tekinolaji ni ivakatakilakila ni sela; 3μl) ena ivakaraitaki ni CCn Incubate na protein A beads (Thermo dauqoli vakasaenisi) vata kei na ivakaraitaki ena 4°C kei na luluqa malumu me baleta na 1 na auwa, qai vakayagataka na chelex beads (Bio-Rad) me vakavutuniyautaki kina na DNA, ka vakayagataka na proteinase K (Thermo dauqoli) me baleta na protein digestion. TNFα veivakatorocaketaki a kunei mai na PCR: ki liu, GGG TAT TGT TGT TGT TGT; ena kena veibasai, GTG CCA ACA LAWA GCC TTT ATA TG (207-bp na ka e buli). Na iyaloyalo e a buli mai na iyaloyalo ni Lab (Bio-Rad) ka vakarautaki ena kena vakayagataki na parokaramu ni komipiuta ni iyaloyaloJ.
Na supernatant ni itovo vakavanua ni sela e a kumuni me vaka e vakamacalataki mai cake. Na vakatulewa a vakayacori me vaka na ivakarau ni dauteitei ni tamata TNFα ELISA iyaya (Invitrogen), tamata IL-2 ELISA iyaya (Invitrogen) kei na tamata IFN-γ ELISA iyaya (Abcam). Me vaka na ivakarau ni dau buli iyaya, na wai e vakayagataki ena 1:100 me laurai kina na TNFα kei na IL-2, kei na 1:3 me laurai kina na IFN-γ. Vakayagataka na EnVision 2104 Multilabel Wilika (PerkinElmer) me vakarautaka na absorbance ena 450 nm.
PBMC era a tawasei mai na iyaya ni veiwasei ni leukocyte (TEkinolaji ni stemCELL) mai na Ficoll ni veivakatorocaketaki ni veivakatorocaketaki ni veivakatorocaketaki. Na CD3 + na sela era a vakatikitikitaki mai na PBMC ena kena vakayagataki na CD3 na mataniciva (Miltenyi). Ena kena tiko se sega na MNA, CD3 + na sela era a vakacakacakataki ena peleti-vakadeitaki CD3 (5μg/ml), CD28 vakawaicalataka (3μg/ml) kei na IL-2 (300 U/ml; Proleukin) me baleta na 3 na siga. Ni oti e 3 na siga, era a kumuni na sela ka savati ena 0.9% saline, ka sa vakamamacataki na peleti. Na wiliwili ni sela a vakayacori ena drodro ni cytometry (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R ituvatuva) ena kena vakayagataki na 123wiliwili ni eBeads.
Vakasuka na veisau me vaka e vakamacalataki mai cake. Na mamaca ni lavelavetaki a vakavoutaki ena dua na vakasama ni 4000 na sela tautauvata/μl. Vakadikeva na ivakaraitaki ena veisautaki ni iwasewase ni chromatography (1290 tawamudu II, tekinolaji ni Agilent, Santa Clara, CA) kei na duru ni CORTECS T3 (2.1 × 150 mm, levu ni tikitiki 1.6-μm, levu ni pore 120-Å; # 186008500, wai). Na ivakatakarakara ni kaukauwa ni Polar (6470, Agilent), ena kena cakacaka na ioni ni livaliva ena ivakarau vinaka. Na iwasewase ni talevoni veikauyaki A e 0.1% na asidi ni fomu (ena H2O), na iwasewase ni talevoni veikauyaki B e 90% na asidi ni fomu, 0.1% na asidi ni fomu. Na LC gradient e 0 ki na 2 na miniti me baleta na 100% A, 2 ki na 7.1 na miniti me baleta na 99% B, kei na 7.1 ki na 8 na miniti me baleta na 99% B. Qai vakatautauvatataka tale na duru kei na iwasewase ni talevoni veikauyaki A ena dua na drodro ni 0.6 ml/min me baleta na 3 na miniti. . Na ivakarau ni drodro e 0.4ml/min, kei na rumu ni duru e vakamamacataki ki na 50°C. Vakayagataka na ivakatagedegede ni kemikali savasava ni MNA (M320995, Kabani ni kemikali ni vakadidike ni Toronto, Vualiku kei Ioka, Ontario, Kenada) me tauyavutaki kina na gauna ni maroroi (RT) kei na veisau (RT = 0.882 na miniti, veisau 1 = 137 → 94.1, veisau 2 = 137 → 137 → 373). Ni yaco kece na tolu na veisau ena gauna dodonu ni maroroi, veisau 1 e vakayagataki me baleta na quantification me vakadeitaka na kena matailalai. Na ivakatagedegede ni curve ni MNA (Kabani ni kemikali ni vakadidike ni Toronto) a vakayacori ena ono na dilutions ni veitarataravi ni iwali ni sitoa (1 mg/ml) me rawati kina na ivakatagedegede ni 0.1, 1.0, 10 kei na 100 ng/ml kei na 1.0 kei na 10μg/ml vakatautauvata wai. Na iyalayala ni kena kunei e 1 ng / mililita, kei na isau ni laini e tiko ena maliwa ni 10 ng / mililita kei na 10 μg / mililita. Na veisele yadua ni rua na microliters ni ivakaraitaki kei na ivakatagedegede e vakayagataki me baleta na vakadidike ni LC/MS, kei na dua na ivakaraitaki ni lewa vinaka veiwaki e cici ena veisele yadua e walu me vakadeitaka na tudei ni ituvatuva ni vakadidike. Na isau ni MNA ni ivakaraitaki kece ni sela ni MNA-vakayacori era tiko ena loma ni laini ni assay. Na vakadidike ni itukutuku a vakayacori ena kena vakayagataki na parokaramu ni komipiuta ni vakadidike ni MassHunter (v9.0, Agilent).
Na ikarua ni itabatamata αFR-CAR tara a tauri mai na Sere kei na so tale. (59). Me vakalekalekataki, na tara e tiko kina na veika oqo: CD8a iliuliu ni veitarataravi, tamata αFR-vakatabakidua na dua-senikau veisau tikitiki, CD8a hinge kei na vanua ni transmembrane, CD27 vanua ni veisele kei na CD3z vanua ni veisele. Na taucoko ni CAR ni veitarataravi a vakarautaki mai na GenScript, ka qai cloned ki na ikarua ni itabatamata ni lentiviral vakaraitaka na vector e cake ni GFP vakaraitaka na kaseti e vakayagataki me vakalewai na kena vakayagataki na veisau.
Na manumanu somidi e buli mai na kena vakayagataki na sela ni HEK293T [isoqoni ni itovo vakavanua ni mataqali ni Amerika (ATCC); tubu ena Dulbecco ni veisautaki ni ikeli veimama e tiko kina na 10% ni dra ni bulumakau (FBS) kei na 1% PenStrep, ka vakayagataki na vector ni CAR-GFP kei na Na supernatant e tiko kina na manumanu somidi a kumuni ni oti e 48 kei na 72 na auwa na kena vakasavasavataki, vakasavasavataki, ka vakabibitaki ena kena vakasavasavataki. Maroroya na veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ni veivakabulabulataki ena -80°C me yacova na kena vakadewataki.
PBMC era sa tawasei mai na bulabula ni dausoli-ka ni veiwasei ni ivoli (STEMCELL tekinolaji) mai na Ficoll ni veivakatorocaketaki ni veivakatorocaketaki ni veivakatorocaketaki. Vakayagataka na digidigi vinaka CD8 lalai (Miltenyi) me vakatikitikitaki kina na CD8 + na sela mai na PBMC. Vakauqeta na sela ni T kei na TransAct (Vakayaloqaqataki) kei na TexMACS veimama [Vakayaloqaqataki; vakaikuritaki ena 3% katakata-vakacacani ni tamata, 1% penStrep kei na IL-2 (300 U / ml)]. Ni oti e ruasagavulu ka va na auwa na veivakauqeti, era a vakadewataki na sela ni T ena lentivirus (10 μl vakaitamera ni manumanu somidi ena 106 na sela). 1 ki na 3 na siga ni oti na veisautaki ena Cytek Aurora (ena FSC (Vakacacani ki liu) / SSC (Vakacacataki ni yasana), duabau, GFP +), vakalewa na GFP vakaraitaka na sela me vakaraitaka e dua na veisautaki ni cakacaka ni lailai duadua 30% .
CAR-T na sela era a vakabulabulataki me baleta na 24 na auwa ena Immunocult (tekinolaji ni stemcell; vakaikuritaki ena 1% PenStrep) ena ruku ni ituvaki oqo: sega ni qaravi, qaravi ena 250 μM adenosine se 10 mM MNA. Ni oti na veiqaravi taumada, era a savati na sela ni CAR-T ena PBS ka cokovata kei na 20,000 na sela ni SK-OV-3 [ATCC; ena McCoy 5A veimama (Sigma-Aldrich) vakaikuritaki ena 10% FBS kei na 1% PenStrep ena 10: Na effector ki na takete ni ratio ni 1 a vakalevutaki ena tolu na kena ikuri ena veimama ni Immunocult vakaikuritaki. SK-OV-3 na sela kei na SK-OV-3 na sela lysed vata kei na digitaki ni saponin (0.5mg / ml; Sigma-Aldrich) a vakayagataki me vaka na lewa ca kei na vinaka, vakatautauvata. Ni oti e 24 na auwa ni co-teitei, na supernatant a kumuni ka vakarautaki na lactate dehydrogenase (LDH) me vaka na veidusimaki ni dau buli iyaya (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Na LDH e vakawaicalataka na 1:50 ena LDH ni veivakabulabulataki. Na pasede ni veivakamatei e a vakarautaki ena kena vakayagataki na fomula oqo: pasede ni veivakamatei = pasede ni veivakadodonutaki / levu duadua ni veivakamatei x 100%, na vanua e pasede ni veivakadodonutaki = co-itovo vakavanua-T sela duadua ga, kei na levu duadua ni veivakamatei = lewa vinaka-lewa ca.
Me vaka e vakamacalataki ena ivola se iyaya kei na iwalewale, vakayagataka na GraphPad Prism 8, Microsoft Excel se R v3.6.0 me baleta na vakadidike ni iwiliwili. Kevaka e vuqa na ivakaraitaki era kumuni mai na tauvimate vata ga (me vaka na ascites kei na vuvuce), eda vakayagataka e dua na veivakatovolei ni t veiwatini se okati kina na tauvimate me vaka e dua na kena revurevu random ena dua na ivakaraitaki ni laini se raraba me vaka e veiganiti. Me baleta na vakadidike ni metabolomics, na veivakatovolei bibi e vakayacori ena tolu na gauna.
Me baleta na ikuri ni iyaya me baleta na itukutuku oqo, yalovinaka raica na http.
Oqo e dua na itukutuku ni rawa-ka e dolavi ka veisoliyaki ena ruku ni veivakadonui ni Creative Commons Attribution-Sega ni Veivoli Laiseni, ka vakatara na kena vakayagataki, veisoliyaki kei na kena vakadewataki ena dua na sala, me vaka ga ni iotioti ni kena vakayagataki e sega ni baleta na rawa-ka vakabisinisi kei na premise sa ikoya na cakacaka taumada e dodonu. Ivakatakilakila.
iVakamacala: Keitou kerei iko ga mo vakarautaka na nomu itikotiko ni imeli me rawa kina vua na tamata o vakatura ki na tabana e kila ni o vinakata me ra raica na imeli ka sega ni spam. Eda na sega ni taura e dua na itikotiko ni imeli.
Na taro oqo e vakayagataki me vakatovolei kina se o iko e dua na dausiko vanua ka tarova na vakau ni spam vakataki koya.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. (Rasili G. Joni), Finiasi T. Hamiltoni (Finiasi T.
MNA e cau ki na kena vakamalumalumutaki na itataqomaki ni T na sela ka matataka e dua na takete ni immunotherapy rawa me baleta na kena qaravi na kenisa ni tamata.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. (Rasili G. Joni), Finiasi T. Hamiltoni (Finiasi T.
MNA e cau ki na kena vakamalumalumutaki na itataqomaki ni T na sela ka matataka e dua na takete ni immunotherapy rawa me baleta na kena qaravi na kenisa ni tamata.
©2021 iSoqosoqo ni Amerika me baleta na Toso ni Saenisi. dodonu kece e maroroi. AAAS es un partner de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef y COUNTER. Na toso ki liu ni saenisi 2375-2548.